腰椎间盘突出症是腰腿痛的一种最为常见的原因,是临床上的常见疾病,好发于30～50岁的体力劳动者或者平时缺乏锻炼的人[1,2]。椎间盘突出等一系列的脊柱退行性病变均会对神经根造成不同程度的压迫,进而导致神经损伤并诱发神经传导阻滞等现象的出现,临床上可以表现为慢性腰背痛与坐骨神经痛等症状,它的根本病理变化就在于病变部位神经根的损伤。统计资料显示,近80%的人一生中或轻或重曾患有下腰痛,在这之中,大多数患者是由于腰椎间盘突出所引起的。目前的研究表明,椎间盘移位后释放大量化学介质,继发无菌性神经根炎而产生的炎症致痛学说已受到国际医学界的公认,并逐步取代了单纯的机械压迫学说[3,4,5]。本实验以LDH根性神经痛SD大鼠为研究对象,通过针刀松解治疗后,检测各组大鼠在实验过程中后肢热刺激缩爪的潜伏期、下丘脑与血浆中生物活性因子八肽胆囊收缩素(CCK-8)、中枢镇痛物质5-羟色胺(5-HT)含量的变化,研究针刀松解法对LDH根性神经痛SD大鼠下丘脑与血浆中CCK-8、5-HT含量的影响,探讨针刀松解对LDH根性神经痛SD大鼠在提高生物活性、中枢镇痛等方面的作用与机制。

1、材料与方法

1.1实验动物及分组

清洁级SD雄性大鼠(240～270g)40只,适应性喂养3d后,按照随机数字表分为假手术组、模型组、针刀组、电针组,每组10只。4组均参加造模。

1.2模型制备

用10%水合氯醛(3.5mL/kg)对大鼠进行腹腔麻醉,将其背部脱毛之后以俯卧位固定在铺有无菌手术巾的手术台上面,并将手术区域暴露出来,用碘伏对大鼠暴露的手术部位进行消毒处理,将L3-4棘突作为中心区域,于大鼠背部正中部位取大约3cm长的切口,依次切开大鼠背部的皮肤、皮下组织与腰背筋膜层,将其背部组织进行钝性分离,直至暴露腰椎旁肌,将其牵开后,用微型咬骨钳将左侧L4棘突及右侧椎板、关节突咬除,暴露L4神经根,将4-0铬制肠线环扎在L4神经根处,其松紧度以肠线接触到神经根但无明显压迫为宜。将切口进行逐层缝合,并洒上青霉素粉末,在术后3d内每日给予大鼠青霉素肌注以预防其手术可能诱发的感染,剂量为8万U/d。

评价模型:等到大鼠于术后清醒之后,观察手术大鼠双下肢有没有瘫痪的情况出现(主要表现为步态不稳或者足外翻),来判定造模是否造成了对大鼠脊髓的损伤。如果没有瘫痪的情况,就对手术大鼠两侧的后足检测热刺激痛觉过敏情况,将大鼠放置在PL-200型热痛测试仪的检测盒之中,辐射热光源经过底部的玻璃板聚焦于大鼠一侧足底的后半部位,其光斑直径为5mm。把大鼠从开始照射到产生缩爪的时间记录下来。每次测试间隔至少为5min,测量3次取其平均值,对大鼠的两侧后足进行交替检测。根据各次检测的平均值求出大鼠两后足进行热刺激后发生缩爪的潜伏期,按公式术前潜伏期-术后潜伏期加以计算,其差值比正常大鼠组的差值大则说明潜伏期下降,对热痛反应发生了痛觉过敏现象,这提示造模成功。

经检测,各组大鼠均造模成功。

1.3各组处理手段

假手术组:手术过程同造模各组,但不用4-0铬制肠线环扎在L4神经根处。手术后正常饲养。

模型组:造模之后正常饲养。

针刀组:造模之后3d后给予针刀干预治疗。施行针刀时先用乙醚将大鼠麻醉约1min,使大鼠不能出现强烈挣扎。选用HZ系列一次性针刀进行干预,规格为0.4mm×40mm(由北京卓越华友医疗器械有限公司生产)。其治疗点选择患椎上下棘之间、患椎上下棘间旁开0.1cm处,患椎上下横突,臀上皮神经走行区域、坐骨神经出口处等部位的条索、结节、压痛点等位置,每次选择2～3个点进行松解。每周干预1次,共干预3次。

电针组:造模之后3d后给予电针干预治疗。取大鼠的环跳、委中穴。取穴方法主要参照《实验针灸学》教材,并且与动物比较学方法进行结合,依据比较解剖取穴法配合模拟骨度取穴法最终确定穴位的具体位置。选用一次性无菌针灸针,规格为0.2mm×13mm(环球牌,由苏州医疗用品厂有限公司生产)。针刺后连接韩氏穴位神经刺激仪,频率2～100Hz,电流强度以造成大鼠后肢轻度抖动为宜,每次刺激20min。隔日治疗1次,1周治疗3次,共治疗3周。

1.4取材与检测指标

后肢热刺激缩爪潜伏期的检测:假手术组、模型组、电针组、针刀组大鼠分别在造模结束后及治疗第1周、第2周、第3周对两侧后肢热刺激缩爪潜伏期进行检测,检测方法如上述,并按公式,术前潜伏期-术后潜伏期进行计算,得出差值。在治疗结束后24h之内进行取材。

血浆:取l%肝素(100L/mL血样)处理试管,干燥后备用。采血之前每个试管加入抑肽酶20L/mL的血样,对SD大鼠进行眼眶取血,然后注进肝素管之内,将该管充分摇匀后,立即放置于4℃冰箱中,3h内以4000r/min的速度进行低温离心,这一过程共进行10min,然后进行血浆的分离,最后放置在-70℃环境中保存,等待检测。

脑组织:在枕骨大孔水平断头处死,从枕骨大孔处开颅取出脑组织,在冰盘上分离出大鼠的下丘脑,并制作成脑匀浆,并于冰皿上编号,样品称重记录后置于生理盐水中煮沸3min,再加入1N冰醋酸0.5mL,充分匀浆,以1NNaOH0.5mL中和,3000r/min低温离心15min,取上清液于-70℃环境中保存,等待检测。

1.5统计学方法

所有检测数据使用SPSS20.0统计学软件进行统计。检测数据是否符合正态性分布,对于符合正态性分布的数据,应用单因素方差分析。当方差分析有显著意义时,进行多组间两两比较,在方差齐时采用Bonferroni法,而方差不齐时采用Tamhane法。对于不符合正态分布的数据,采用非参数检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2、结果

2.1各组大鼠后肢热刺激缩爪潜伏期比较

表1显示,模型组在术后第1周时开始出现术侧后足热刺激缩爪潜伏期缩短(热刺激痛觉过敏现象),与术前及假手术组比较差异有统计学意义(P<0.05);第3周时潜伏期缩短最明显,与术前及假手术组比较差异有统计学意义(P<0.01);针刀组、电针组大鼠在治疗第2周时开始出现两足热刺激缩爪潜伏期差值明显减小(热刺激痛觉过敏现象减轻),与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。假手术组大鼠在各时相点热刺激缩爪潜伏期差值与针刀组、电针组比统差异无统计学意义(P>0.05)。

表1各组大鼠后肢热刺激缩爪潜伏期比较

2.2各组大鼠下丘脑中CCK-8含量比较

表2显示,与假手术组相比,模型组大鼠下丘脑中CCK-8含量明显上升(P<0.01);电针组、针刀组CCK-8含量有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,假手术组、电针组、针刀组下丘脑中CCK-8含量明显降低(P<0.01);与电针组相比,模型组CCK-8含量明显上升(P<0.05);针刀组、假手术组含量降低(P<0.05)。

表2各组大鼠下丘脑中CCK-8含量比较

2.3各组大鼠血浆CCK-8含量比较(表3)

表3各组大鼠血浆CCK-8含量比较

表3显示,与假手术组相比,模型组大鼠血浆CCK-8含量明显上升(P<0.01);电针组、针刀组CCK-8含量有所下降,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,假手术组、电针组、针刀组血浆中CCK-8含量有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);与电针组相比,模型组CCK-8含量明显上升(P<0.05);针刀组、假手术组含量变化不明显(P>0.05)。

2.4各组大鼠下丘脑及血浆中5-HT含量比较

表4显示,与假手术组相比,模型组下丘脑及血浆中5-HT含量明显降低(P<0.01);电针组、针刀组5-HT含量有所上升,但差异无统计学意义(P>0.05);与模型组相比,假手术组、电针组、针刀组下丘脑及血浆中5-HT含量明显上升(P<0.01);与电针组相比,模型组下丘脑及血浆中5-HT含量明显降低(P<0.05);针刀组、假手术组含量较高(P<0.05)。

表4各组大鼠下丘脑及血浆中5-HT含量比较

3、讨论

针刀松解作为一种治疗慢性软组织损伤的有效手段,将传统针灸方法与西医外科手术刀相结合,能够松解粘连、刮除瘢痕、消除痉挛,恢复软组织的动态力学平衡。而电针则是对传统针灸学的继承与发扬,它结合了针与电两种刺激手段,能够有效提高临床疗效,且可以较为准确地掌握刺激参数,并代替了手法运针,节省人力,故目前也广泛地应用于针灸治疗中[6]。本实验将这两种较为有效的治疗手段进行对比,具有较高的临床价值与意义。

胆囊收缩素(CCK)作为目前典型的脑肠肽与免疫调节肽之一,本身存在很多形式的分子结构,而八肽胆囊收缩素(CCK-8)作为体内含量最高的一种胆囊收缩素,是目前已知的最小分子形式的胆囊收缩素,且具备了全部生物活性[7,8]。在生物体内,CCK-8通过旁分泌、内分泌、自分泌等各种形式作用在靶细胞处,与其受体CCK1或者CCK2相结合,介导着相关的适应性细胞,并保护着机体内环境的稳定[9]。根据目前有关的科研报道,CCK-8可以有效调节各组织免疫细胞的增殖、趋化、粘附及免疫杀伤作用,目前认为CCK-8的调节作用主要存在两种途径,一为脑组织分泌的CCK-8的中枢效应,二为腹迷走神经传入纤维所介导的外周CCK-8的作用机制[10,11,12,13,14]。依据本次实验结果分析,模型组大鼠下丘脑及血浆中CCK-8的含量与假手术组相比明显上升,这表明CCK-8作为一种神经递质,反应着机体对于疼痛程度的敏感性,在中枢或外周镇痛的研究中均起着极具代表性的作用;当腰椎间盘突出症产生疼痛与神经损伤时,CCK-8的含量会明显上升,而电针或者针刀的刺激,能够使CCK-8的含量有所下降,这提示,下丘脑和血浆中CCK-8含量的降低很可能是电针或者针刀镇痛的机制之一。

5-HT,又称为血清素,是一种自体活性物质,大约90%的该物质合成并分布在肠嗜铬细胞中,一般与ATP等成分共同储存在细胞颗粒之中[15]。5-HT作为目前周知的神经递质之一,集中分布在机体内的松果体与下丘脑等组织中,而于脑内组织中,又集中存在于下丘脑视交叉上核(SCN)[16,17,18]。研究表明,该物质可能与机体对于痛觉的感受、睡眠的调节、体温的稳定等功能密切相关。外周组织中的5-HT是强血管收缩剂与平滑肌收缩刺激剂的一种,而中枢神经系统中的5-HT则是一种镇痛物质。在各种刺激的作用中,5-HT调控着脊髓水平下行的伤害性刺激,并进一步通过5-HT受体(5-HT1,5-HT2,5-HT3,5-HT4,5-HT5,5-HT6,5-HT7)的作用,激动或拮抗机体内的信号转导,从而延缓或者阻断伤害性冲动的传导,以降低机体对于疼痛性等各种伤害性刺激的反应性与敏感性[19,20,21,22]。依据实验结果分析,模型组下丘脑及血浆中5-HT浓度明显低于假手术组,有极显著性差异,这说明模型鼠因为髓核发生的炎症反应使得机体释放的5-HT受体明显增加,这些受体与5-HT相结合,使得作用在机体的神经末梢上的镇痛物质减少,从而造成了机体产生痛觉过敏与痛反应;而在针刀或者电针的治疗之后,下丘脑与血浆中5-HT的含量均有了明显的上升,与模型组相比,具有显著性差异,这说明针刀、电针这两种治疗手段都可以增加中枢与外周5-HT的释放,从而抑制疼痛的发生。

本实验提示针刀松解、电针治疗对LDH根性神经痛有明显的镇痛作用,而CCK-8与5-HT作为机体内较为敏感的生物活性物质与神经递质,其诱导产生的信号转导通路的应答,是鉴定这两种治疗方法是否有效的依据之一[23]。针刀松解治疗LDH根性神经痛在产生局部松解作用的基础之上,直接刺激神经根,诱发需经CCK-8或5-HT诱导的信号转导机制,从而激发体内下丘脑-垂体-肾上腺轴的调节,从神经、体液、免疫3个方面共同作用,减轻疼痛刺激,缓解不良反应[24,25,26,27]。而电针则是以神经电生理、疼痛物质变化为切入点进行治疗。通过本次实验,对于针刀治疗LDH的作用机制进行了探索,为更深入地研究LDH的发病机制及其病理转变提供了有效的实验依据,为针刀治疗该病提供了实验参考,为临床治疗该病扩展了思路。

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