急性脑梗死是一种与神经系统缺陷有关的常见的疾病，症状包括痴呆、失语和偏瘫[1]。ACI发作后脑血流量减少，引起一系列复杂的病理过程，包括炎症反应和氧化应激，进一步导致大量细胞死亡和脑损伤。脑血管血流的阻塞可能会导致不同程度的症状和结果，具体取决于阻塞血管所供应大脑的面积范围和区域重要程度，例如受影响的大脑会导致对侧身体的感觉丧失或麻痹，视力和语言问题，记忆力减退甚至死亡[2]。

近年来，由神经元、星形胶质细胞、脑微血管内皮细胞、周细胞和细胞外基质成分组成的神经血管单元成为研究的重点。大脑的正常生理功能取决于NVU内的各种细胞相互作用[3]。NVU内的血-脑脊液屏障（bloodbrainbarrier,BBB）可以防止有害物质进入大脑，但脑缺血后BBB会被破坏，并可能会进一步加剧缺血性损伤[4]。因此，NVU可能是ACI综合治疗的重要靶标。Cx43是大脑中最丰富连接蛋白，主要在星形胶质细胞中表达。每个Cx43间隙连接通道（gapjunctionchannel,GJC）由2个连接蛋白半通道组成，每个半通道由6个连接蛋白组成[5]。Gap26和Gap27通过抑制Cx43半通道（hemichannels,HCs）发挥对缺血性损伤的保护作用[6]。最新研究，Gap19(KQIEIKKFK）是一种Cx43HCs特异性抑制剂，其靶向Cx43CLpH受体结构域，阻断HC，但不阻断GJC[7]。Gap19在体外心脏缺血再灌注模型中抑制质膜和线粒体Cx43半通道并减少梗死面积[8]。表皮生长因子（epidermalgrowthfactor,EGF）通过激活JAK2/STAT3通路在脑缺血再灌注损伤后发挥保护作用，该保护作用可能与抑制Cx43和抑制细胞凋亡有关[9]。通过栓线法建立ACI模型，探究Gap19通过介导Cx43半通道活性和JAK2/STAT3通路对ACI大鼠的影响，以期为ACI发病机制的阐明及疾病的治疗提供新的科学资料。

材料和方法

1.材料

大鼠海马神经元细胞、大鼠星形胶质细胞、大鼠BMECs和海马神经元细胞完全培养基均购自北京百欧博伟生物技术有限公司；TAT-Gap19（简称Gap19）购自美国R&DSystems公司；2,3,5-三苯基氯化四氮唑2,3,5,tripheyltetrazoliumchloride(TTC）和溴化乙锭均购自美国Sigma公司；ECL发光液购自北京雷根生物技术有限公司；DMEM培养基购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；pJAK2、pSTAT3抗体购自美国CellSignalingTechnology公司；Bax、Bcl-2、caspase-3、Cx43、β-Tubulin、JAK2和STAT3抗体购自中国Proteintech公司；HRP标记二抗购自北京全式金公司；恒温培养箱购自美国Thermo公司；荧光显微镜购自德国Zeiss公司。

2.动物饲养、模型制备、给药处理及脑梗死面积测定

24只Sprague–Dawley(SD）成年雄性大鼠购自新疆医科大学动物实验研究中心。SD大鼠饲养于温度23±2℃、相对湿度40%～70%环境中，保持通风换气和垫料干燥，提供充足饮水和饲料。待SD大鼠适应环境1w后，将24只SD大鼠随机分为3组：对照组、MCAO组和MCAO+Gap19组，每组各8只。

MCAO组和MCAO+Gap19组参照Longa等[10]建立的栓线法建立MCAO模型。具体步骤如下：10%水合氯醛（400mg·kg-1）腹膜内麻醉大鼠，分离暴露右颈总动脉。尼龙线插入颈内动脉，并进一步推进至颅内，直至闭合动脉的起点。1.5h后将栓线拔出。对照组大鼠进行相同的外科手术操作，但不插入栓线。造模后24h按照分组进行给药：MCAO+Gap19组腹腔注射Gap19(25mg·kg-1），对照组和MCAO组腹腔注射等量ddH2O。

TTC染色检测大鼠脑梗死面积：各组大鼠给药2h后，断头法处死大鼠后迅速取脑，-20℃条件下冷冻30min。切取冠状位脑片，2%TTC溶液37℃避光孵育30min,PBS洗涤脑片，4%多聚甲醛固定脑片24h。ImageJ软件分析梗塞面积，梗死面积百分比=(梗死面积/全心面积)×100%。

3.神经功能缺损评估

改良的神经系统严重程度评分（mNSS）测试[11]包括运动、感觉、平衡和反射方面的检测，最高分值为18，分数越高表示神经系统损伤越大。

4.细胞培养

脑微血管内皮细胞（BMECs）：细胞用DMEM培养基（含有20%FBS、2mML-谷氨酰胺、1%青霉素链霉素、0.1mM非必需氨基酸和50μg·mL-1DNaseI的DMEM),37℃、5%CO2条件下培养，2～3d更换一次培养基。

星形胶质细胞：细胞用含10%FBS,1%青霉素链霉素的DMEM培养基，37℃、5%CO2条件下培养，2～3d更换一次培养基。

海马神经元细胞：细胞用海马神经元完全培养基，37℃，5%CO2条件下培养，2～3d更换半量培养基。

5.体外神经血管单元模型的构建

参考文献[12]构建NVU模型。将神经元以0.5×105个/cm2密度接种于6孔板，37℃，5%CO2条件下培养2d后，将星形胶质细胞以1.5×105个/cm2的密度接种在插入膜外侧，4h后，将插入膜置于装有神经元的6孔板中。BMECs以1.0×105个/cm2的密度接种于插入膜内侧。共培养5d后，进行后续实验。

6.氧葡萄糖剥夺（oxygenglucosedeprivation,OGD）实验

将NVU模型培养于无葡萄糖培养基中（无葡萄糖，98.5mMNaCl,10.0mMKCl,1.2mMMgSO4、0.9MmNa2HPO4、6.0mMNaHCO3、1.8mMCaCl2、40mM乳酸钠和20mMpH6.8的HEPES），并置于37℃、5%CO2和1%O2条件下放置6h。随后将NVU模型恢复正常培养。

7.CCK-8

星形胶质细胞（5×103个/孔）接种于96孔板。37℃、5%CO2条件下培养24h后，进行OGD操作，随后加入Gap19(10μM组；50μM;100μM;150μM）孵育，对照组和OGD组加入等量ddH2O。37℃、5%CO2条件下培养24h后，每孔内加入CCK-810μL,37℃孵育3h,450nm处测定OD值。基于CCK-8实验结果，选取50μM为Gap19最佳给药浓度。NVU模型进行分组给药：Gap19组（50μM);OGD+Gap19组（50μM）；对照组（等量ddH2O);OGD组（等量ddH2O）。

8.Westernblot检测

收集NVU模型，RIPA裂解液裂解后，离心取上清液。BCA法检测蛋白浓度。取25μg蛋白SDS-PAGE分离，将蛋白转印至PVDF膜上。10%脱脂奶粉室温封闭3h,Cx43(1:1000）、Bax(1:1000）、Bcl-2(1:1500）、cleavedcaspase-3(1:2000）、JAK2(1:1000）、STAT3(1:1000）、pJAK2(1:2000）、pSTAT3(1:2000）和β-Tubulin(1:2000）抗体4℃过夜孵育，TBST清洗后，HRP标记二抗（1:2000）室温孵育1h。TBST清洗后，ECL化学发光法检测蛋白条带并拍照。

9.细胞免疫荧光

4%多聚甲醛室温固定OGD损伤后星形胶质细胞15min,1%TritonX-100通透，5%脱脂奶粉37℃封闭1h,Cx43(1:200）和pSTAT3(1:500）抗体1:1混合，37℃孵育1h,PBST清洗后，荧光二抗（1:500）室温孵育1h，随后DAPI室温染核10min,PBST清洗后，荧光显微镜拍照。

10.溴化乙锭（ethidiumbromide,EtBr）摄取检测半通道活性

将BMECs、星形胶质细胞、神经元细胞分别接种于24孔板上（2.5×105个/孔）。OGD处理后，Hank's平衡盐溶液洗涤细胞，每孔加入5μMEtBr在37℃下孵育10min。4%多聚甲醛固定细胞，荧光显微镜观察并拍照，ImageJ软件分析EtBr阳性细胞数。

11.统计学方法

采用SPSS21.0统计学软件进行数据分析，所有数据均表示为±s。两组间样本比较采用独立样本t检验，多组间样本比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1.Gap19减少MCAO大鼠脑梗死面积，改善神经功能缺损（图1)

图1Gap19改善MCAO大鼠脑梗死面积和神经功能缺损

TTC染色检测大鼠脑梗死面积，神经系统严重程度评分（mNSS）检测神经功能缺损，结果显示，与对照组相比，MCAO组大鼠脑梗死面积和神经功能缺损均显著上调（图1A、B,P<0.05）；与MCAO组相比，MCAO+Gap19组大鼠脑梗死面积和神经功能缺损均显著下调（图1A、B,P<0.05）。

2.Gap19促进OGD损伤后星形胶质细胞活力，抑制NVU模型中Cx43的蛋白表达和细胞凋亡（图2)

图2Gap19促进OGD损伤后星形胶质细胞活力，抑制NVU模型中Cx43的蛋白表达和细胞

CCK-8检测星形胶质细胞活力，Westernblot检测NVU模型中Cx43、cleavedcaspase-3、Bcl和Bax蛋白表达，结果显示，与对照组相比，OGD组星形胶质细胞活力显著下调（图2A,P<0.05),NVU模型细胞Cx43的蛋白表达和细胞凋亡均显著上调（图2B、C、D,P<0.05）；与OGD组相比，Gap19在50μm和100μm浓度下均能显著上调星形胶质细胞活力（图2A,P<0.05），其中50μm浓度下更为明显，Gap19还显著下调NVU模型Cx43的蛋白表达和细胞凋亡（图2B、C、D,P<0.05）。

3.Gap19处理抑制星形胶质细胞的Cx43半通道活性（图3)

图3Gap19处理抑制星形胶质细胞的Cx43半通道活性

溴化乙锭摄取实验检测星形胶质细胞的半通道活性，结果显示，与对照组相比，OGD组BMECs、神经元细胞和星形胶质细胞的半通道活性均显著上调（图3A、B、C、D,P<0.05）；与OGD组相比，Gap19星形胶质细胞的半通道活性显著下调（图3A、D,P<0.05），而BMECs和神经元细胞的半通道活性无显著变化（图3A、B、C,P>0.05）。

4.Gap19促进OGD损伤后NVU模型JAK2/STAT3通路活化（图4)

图4Gap19促进OGD损伤后NVU模型JAK2/STAT3通路活化

Westernblot检测OGD损伤后NVU模型JAK2和STAT3磷酸化水平，结果显示，与对照组相比，OGD组NVU模型JAK2和STAT3磷酸化水平均显著上调（图4A、B,P<0.05）；与MCAO组相比，OGD+Gap19组NVU模型JAK2和STAT3磷酸化水平均显著上调（图4A、B,P<0.05）。

5.OGD损伤后星形胶质细胞中pSTAT3和Cx43的共定位（图5)

图5OGD损伤后星形胶质细胞中pSTAT3和Cx43的共定位

免疫荧光双染法检测星形胶质细胞中pSTAT3和Cx43的表达，结果显示，OGD损伤后星形胶质细胞中pSTAT3和Cx43存在共定位。

讨论

ACI是神经功能障碍和残疾的最常见原因，这种疾病通常是长期的，甚至是终身的[13]。组织纤溶酶原激活剂（TPA）是脑梗死的常见治疗方法，但由于其有效时间窗狭窄，具有继发性出血的高风险，且医疗费用昂贵[14]，因此，针对脑梗死疾病开发更为有效、经济的疗法具有重要意义。NVU被认为是大脑功能和结构的基础[15]。Cx43间隙连接通道是NVU内的重要信号通道，Cx43主要存在于星形胶质细胞中[16]。星形胶质细胞在神经元和BMECs间的通讯中起关键作用，通过释放各类因子维持BMECs和神经元的功能[15]。缺血后Cx43HCs的开放可能会将神经毒性物质传播到未受损的细胞，并进一步加剧缺血性脑损伤[17]。在脑缺血-再灌注损伤后，JAK2/STAT3通路的激活可能与脑Cx43的抑制相关[9]。本研究通过建立ACI体内外模型，探讨Gap19通过介导Cx43半通道活性和JAK2/STAT3通路对ACI大鼠的作用，以期为ACI疾病的治疗提供新的科学依据。

Gap19靶向Cx43CLpH受体结构域，阻断HC，但不阻断GJC[7]。Walrave等[18]研究，TAT-Gap19通过抑制Cx43半通道防止癫痫发作。星形胶质细胞中Cx43间隙连接对ACI神经元存活有重要影响，永久性大脑动脉闭塞2h和3h后，核心缺血区域Cx43蛋白表达增加[19]。ACI会导致大鼠脑中Cx43蛋白表达水平上调，电针处理可减少脑梗死面积，并抑制Cx43蛋白的表达[20]。Gap19可逆转Cx43过表达引起的细胞凋亡[21]。本研究结果显示，MCAO处理导致大鼠脑梗死面积和神经功能缺损均显著上调，而Gap19处理后，大鼠脑梗死面积和神经功能缺损均显著下调；随后，构建了OGD处理的NVU模型，以模拟ACI损伤的体内过程，结果显示，OGD处理导致NVU模型Cx43的蛋白表达和BMECs、神经元细胞和星形胶质细胞的半通道活性均显著上调，细胞活力显著下调；Gap19处理显著上调OGD后NVU模型细胞活力，并抑制Cx43的蛋白表达和星形胶质细胞的半通道活性，而BMECs和神经元细胞的半通道活性无显著变化，说明Gap19可通过抑制Cx43半通道活性，促进NVU细胞活力，发挥对ACI大鼠的保护作用。该结果与CX43半通道的抑制可减轻脑缺血/再灌注损伤一致[22]。

JAK2/STAT3通路与心肌缺血-再灌注的保护作用密切相关[23,24]。脑缺血-再灌注（I/R）损伤后，JAK2/STAT3通路被激活，EGF通过激活JAK2/STAT3通路在I/R损伤后发挥保护作用[9]。银杏内酯K通过激活JAK2/STAT3通路增加HIF-1α/VEGF的表达，来促进缺血性卒中后的血管生成[25]。I/R损伤可诱导细胞凋亡，激活STAT3可通过上调Bcl-2和下调Bax来减少细胞凋亡[26,27]。本结果显示，OGD损伤后NVU模型细胞凋亡、JAK2和STAT3磷酸化水平均显著上调，Gap19可显著上调JAK2和STAT3磷酸化水平，抑制细胞凋亡，以上结果说明，Gap19可能通过激活JAK2/STAT3通路抑制OGD损伤后NVU模型细胞凋亡，从而发挥保护作用。随后本研究通过免疫荧光染色确定了Cx43与pSTAT3的共定位关系，说明Gap19通过抑制Cx43和激活STAT3发挥对ACI的保护作用。研究表明，JAK2-STAT3信号通路介导G-CSF对兔选择性冠状动脉微栓塞后心肌Cx43表达[28],JAK2/STAT3途径通过激活EGFR在I/R损伤中起着至关重要的保护作用，神经保护作用可能与抑制Cx43表达和抑制细胞凋亡有关[9]。因此，推测Gap可能通过激活JAK2/STAT3途径抑制Cx43表达及半通道活性发挥对ACI大鼠的保护作用。

综上所述，Gap19通过抑制Cx43半通道和活化JAK2/STAT3通路发挥对ACI大鼠的保护作用。然而，在脑梗死疾病中JAK2/STAT3通路是否参与Cx43表达和半通道活性还尚未可知，需要进一步研究阐明。

参考文献：

[28]叶树华.JAK2-STAT3信号通路介导G-CSF对兔选择性冠状动脉微栓塞后心肌Cx43表达和室性心律失常易感性的影响[D].福建医科大学,2016.

米克拉依·阿不来提,赵茜.Gap19介导Cx43半通道抑制JAK2/STAT3通路活化对急性脑梗死大鼠的保护作用[J].脑与神经疾病杂志,2020,28(10):620-626.

基金:新疆维吾尔自治区自然科学基金项目(2019D01C046).