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生姜挥发油对脑缺血再灌注大鼠溶酶体-线粒体途径凋亡的影响

2020-10-09 147 上传者：管理员

摘要：目的：探讨生姜挥发油对脑缺血再灌注损伤大鼠溶酶体-线粒体途径凋亡的影响。方法：将大鼠随机分为假手术组、模型组、尼莫地平组（30mg•kg-1，阳性对照组）、生姜挥发油高剂量组（0.12mL•kg-1）和生姜挥发油低剂量组（0.06mL•kg-1）。各组大鼠灌胃给予相应的药物，假手术组和模型组给予等体积的1%的吐温80溶液，每天给药1次，连续给药3d。末次给药1h后行手术，用四动脉阻断法复制脑缺血再灌注大鼠模型，再灌注30min后取大脑；假手术组只分离血管不结扎。用原位末端标记法（TUNEL）检测大鼠脑组织细胞凋亡，蛋白免疫印迹法（WesternBlot）测定细胞色素C（CytochromeC,CytC）、组织蛋白酶B（CathepsinB,CTSB）和组织蛋白酶D（CathepsinD,CTSD）的蛋白表达。结果：与假手术组比较，模型组皮层中凋亡细胞数明显增加（P<0.01），皮层和海马中细胞色素C、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D蛋白表达均明显升高（P<0.01）；与模型组比较，生姜挥发油高、低剂量组皮层中凋亡细胞数均明显降低（P<0.01），生姜挥发油高剂量组的皮层和海马中细胞色素C、组织蛋白酶B和组织蛋白酶D蛋白表达均明显降低（P<0.01,P<0.05），生姜挥发油低剂量组的皮层中组织蛋白酶B蛋白表达也明显降低（P<0.05）。结论：生姜挥发油可能通过阻断溶酶体-线粒体途径抑制脑缺血再灌注模型大鼠神经细胞的凋亡，从而发挥保护脑损伤的作用。

关键词：
凋亡
生姜挥发油
细胞色素C
脑缺血再灌注
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中国是全球范围内脑卒中压力最大的国家，在过去30年内脑卒中发病率、死亡率一直呈上升趋势，农村和北方地区情况尤为严峻[1]。目前缺血性脑卒中急性期的二级预防药物主要是抗凝药，但由于出血风险比较大，实际使用率并不高，因此迫切需要寻求更安全有效的药物。研究[2,3]发现，脑缺血再灌注后，梗死灶边缘检测到大量的凋亡细胞，药物、电针等疗法可通过抑制神经元凋亡，缩小脑缺血后梗死灶体积，改善神经行为学能力。众所周知，线粒体信号通路是细胞凋亡主要的内源性通路，然而近年来研究[4,5]发现溶酶体也参与和调控细胞凋亡，线粒体和溶酶体相互影响共同调控凋亡进程。

生姜为姜科植物姜（ZingiberofficinaleRosc.）的新鲜根状茎，药食两用，临床应用广泛，药理作用包括止呕、保护心脑血管系统等[6]。本课题组前期研究[7,8]发现，生姜提取物可保护脑缺血再灌注损伤大鼠的神经细胞、减少细胞凋亡，但还不清楚其作用机制。本研究通过复制脑缺血再灌注大鼠模型，观察生姜挥发油对大鼠脑组织细胞凋亡以及皮层和海马中细胞色素C(cytochromeC,CytC）、组织蛋白酶B(CathepsinB,CTSB）、组织蛋白酶D(CathepsinD,CTSD）蛋白表达的影响，以期从溶酶体-线粒体途径凋亡的角度探讨生姜挥发油保护脑缺血再灌注损伤可能的作用机制。

1、材料与方法

1.1动物

SD大鼠50只，雄性，SPF级，10周龄，体质量（240±10)g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证号：SCXK（京）2012-0001，动物质量合格证号：11400700115956，饲养于河南省中医药研究院动物中心。本研究的动物实验设计通过了河南省中医药研究院实验动物伦理审查。

1.2药物及试剂

生姜产于四川犍为，由河南省中医药研究院马开副研究员鉴定，用蒸馏法提取生姜挥发油，用吐温80将生姜挥发油制成乳状混悬液后给大鼠灌胃。尼莫地平片，德国拜耳医药保健有限公司，批号：BJ27586；细胞凋亡检测试剂盒（批号：10L04A22）、彩色预染中分子量蛋白质marker（批号：11F03A13），均购自武汉博士德生物工程有限公司；蛋白抽提试剂盒，北京普利莱基因技术有限公司，批号：PL-2016-02;BCA法蛋白定量试剂盒，雷根生物技术有限公司，批号：1202A15;SDS-PAGE凝胶制备试剂盒，康为世纪生物科技有限公司，批号50131；山羊抗组织蛋白酶D(R-20）抗体（批号：SC6487），小鼠抗细胞色素C(A-8）抗体（批号：SC1915），均购自美国Santacruze科技公司；兔抗组织蛋白酶B抗体，百奇生物科技有限公司，批号：20151228；兔抗β-actin抗体（批号：00045134）、兔抗β-tubulin抗体（批号：00043981）、羊抗小鼠二抗（批号：20000081）、驴抗山羊二抗（批号：20000004），均购自武汉三鹰生物技术有限公司；山羊抗兔二抗，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号：122825；疏水性PVDF膜，美国Millipore公司。

1.3仪器

DM4000B型光学显微镜，德国Leica公司；DYY-7C型电泳仪电源，美国Bio-rad公司；DYCF-40型转印电泳仪、WD-9412A恒温循环器，北京六一生物仪器厂；FluorchemHD2Western成像系统，美国AlphaInnotech公司。

1.4分组与给药

大鼠经适应性喂养后，根据体质量随机分为5组，即假手术组、模型组、尼莫地平组（30mg·kg-1，阳性对照组）、生姜挥发油高剂量组（0.12mL·kg-1）、生姜挥发油低剂量组（0.06mL·kg-1），每组10只。灌胃给药，给药体积为10mL·kg-1，每天1次，连续给药3d。假手术组和模型组给予等体积的1%的吐温80溶液。

1.5模型复制[9]

末次给药1h后行手术，用Pullinsin四动脉阻断法复制脑缺血再灌注（Cerebralischemiareperfusion,CIR）模型。大鼠用水合氯醛麻醉后俯卧位，暴露第一颈椎两侧翼状孔，用电凝针迅速灼烧两侧的椎动脉，造成永久性闭塞。24h后，暴露并游离出双侧颈总动脉，夹闭双侧颈总动脉10min，松开动脉夹行再灌注。假手术组仅分离血管，不电凝椎动脉和夹闭颈总动脉。模型复制成功和存活大鼠数量为模型组、尼莫地平组和生姜挥发油低剂量组各7只，生姜挥发油高剂量组8只。每组取5只大鼠用于原位末端标记法（TdT-mediateddUTPNickEndLabeling,TUNEL）和蛋白免疫印迹法（WesternBlot）检测。

1.6样本采集

再灌注30min后将大鼠断头，冰上取脑，去除小脑和嗅球，将大脑分为左右半球。左半球用多聚甲醛固定，用于检测细胞凋亡；右半球分离皮层和海马后，用于测定蛋白表达。

1.7TUNEL法检测细胞凋亡

石蜡包埋大脑左半球，制得5μm的冠状切片。用二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，proteinaseK消化，TdT和DIG-dUTP标记，封闭后与生物素化抗地高辛抗体反应，加入SABC-AP后用BCIP/NBT显色，核固红复染。凋亡细胞核中显示紫蓝色颗粒，在200倍光学显微镜下随机选取皮层5个视野计数。

1.8WesternBlot法测定细胞色素C、组织蛋白酶B、组织蛋白酶D的表达

用蛋白抽提试剂盒分别提取各组大鼠皮层及海马中的总蛋白，BCA法测定蛋白含量，配制蛋白样品上样体系后用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白。湿法电转移蛋白到PVDF膜上，转膜后用5%脱脂奶粉封闭1h，再分别加入小鼠抗细胞色素C抗体（1∶3000）、兔抗组织蛋白酶B抗体（1∶2000）、山羊抗组织蛋白酶D抗体（1∶1600),4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5min。然后再与HRP标记的山羊抗小鼠二抗（1∶3000）、山羊抗兔二抗（1∶5000）、驴抗山羊二抗（1∶2500）室温下反应1h,TBST洗膜3次。超敏ECL化学发光检测试剂盒显影后，用AlphaViewSA图像分析处理软件检测目的条带和内参蛋白β-actin、β-tubulin的表达，测定条带的灰度值，用目的条带灰度值和内参条带灰度值的比值表示蛋白相对表达量。

1.9统计学处理方法

用SPSSstatistics19.0统计软件处理实验数据，所有数据符合正态分布，以均数±标准差（±s）表示。多组间均数比较用单因素方差分析（AnalysisofVariance,ANOVA）。当数据符合方差齐性时，各组之间两两比较用LSD法检验；当数据不符合方差齐性时，用Welch法检验，两两比较用Dunnett’sT3。P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1对脑缺血再灌注大鼠脑组织中细胞凋亡的影响

见图1、表1。与假手术组比较，模型组皮层区的凋亡细胞数明显增加（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组、生姜挥发油高剂量组和生姜挥发油低剂量组皮层区的凋亡细胞数均明显减少（P<0.01）。

图1各组脑缺血再灌注大鼠脑组织中细胞凋亡的情况（TUNEL，×200)

表1生姜挥发油对脑缺血再灌注大鼠皮层中细胞凋亡的影响

2.2对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中细胞色素C蛋白表达的影响

见图2、表2。与假手术组比较，模型组皮层和海马中的细胞色素C蛋白表达均明显增加（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和生姜挥发油高剂量组的皮层和海马中细胞色素C蛋白表达均明显减少（P<0.01）。

图2各组脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中细胞色素C(CytochromeC）蛋白表达的条带图

表2生姜挥发油对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中细胞色素C蛋白表达的影响

2.3对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶B蛋白表达的影响

见图3、表3。与假手术组比较，模型组皮层和海马中组织蛋白酶B蛋白表达均明显增加（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组大鼠海马、生姜挥发油高剂量组皮层和海马及低剂量组皮层中的组织蛋白酶B蛋白表达均明显减少（P<0.01,P<0.05）。

图3各组脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶B(CathepsinB）蛋白表达的条带图

表3生姜挥发油对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶B蛋白表达的影响

2.4对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶D蛋白表达的影响

见图4、表4。与假手术组比较，模型组皮层和海马中组织蛋白酶D蛋白表达均明显增加（P<0.01）；与模型组比较，尼莫地平组和生姜挥发油高剂量组皮层和海马中组织蛋白酶D蛋白表达均明显减少（P<0.01,P<0.05）。

图4各组脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶D(CathepsinD）蛋白表达的条带图

表4生姜挥发油对脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶D蛋白表达的影响

3、讨论

线粒体是凋亡过程中至关重要的细胞器，细胞遭遇缺血、缺氧等损伤后，Bcl-2蛋白家族控制线粒体通透性转换孔异常开放，导致线粒体内膜的跨膜电位下降，细胞色素C释放到细胞质中，通过生成凋亡小体，激活下游执行Caspase蛋白，细胞从而发生凋亡[10,11]。细胞质中细胞色素C表达上调是线粒体产生凋亡的主要标志，抑制细胞色素C的释放，减少神经元凋亡有助于脑功能恢复[12]。陈琪等[13]研究显示，脑缺血后小鼠的皮层、海马、丘脑中细胞色素C表达均明显增高，外源性的胰岛素样生长因子1干预后，可明显降低脑组织多个结构的细胞色素C水平，且呈剂量依赖性。本研究采用四动脉阻断法复制脑缺血再灌注损伤大鼠模型，检测生姜挥发油对大鼠脑组织细胞凋亡及皮层和海马中细胞色素C蛋白表达的影响。结果显示，脑缺血再灌注模型组凋亡细胞数明显增多，皮层和海马中细胞色素C蛋白表达明显增加，生姜挥发油能明显减少凋亡细胞数，同时降低皮层和海马中细胞色素C蛋白表达。

近年来，学者们[4,14]逐渐认为存在溶酶体-线粒体途径的凋亡，溶酶体受内源性或外源性因素的诱导发生裂解，释放溶酶体酶等内容物激活线粒体凋亡，溶酶体和线粒体相互影响，是增强的环状反应。脑缺血后溶酶体屏障功能被破坏，部分溶酶体膜通透性（lysosomalmembranepermeabilization,LMP）升高，组织蛋白酶泄漏到细胞质中，激活Bcl-2蛋白家族，导致线粒体外膜穿孔，释放细胞色素C等内容物，启动线粒体途径的凋亡[5]。同时，线粒体周围的活性氧或者促凋亡因子也会调控溶酶体膜通透性，影响溶酶体的稳定性[15]。当线粒体膜电位完全降低时凋亡已难以逆转，而溶酶体膜损伤发生在线粒体凋亡之前，维持溶酶体膜完整性可能是阻止凋亡发生更可靠的方式[16]。

溶酶体调控凋亡的功能依赖于组织蛋白酶，其中组织蛋白酶B和组织蛋白酶D是凋亡相关的关键蛋白酶，衡量溶酶体膜通透性可用组织蛋白酶的含量表示，抑制组织蛋白酶的表达有助于保护脑缺血损伤[17]。研究[18,19]发现在脑缺血再灌注大鼠模型和局灶性脑缺血大鼠模型中均可检测到组织蛋白酶的泄漏，组织蛋白酶B水平异常升高，同步出现细胞核固缩等变化，CA074-Me预处理能保护受损的溶酶体，阻止大鼠CA1区和丘脑的神经元凋亡，减少大鼠脑缺血再灌注的继发性损害。另外，银杏内酯B可通过降低组织蛋白酶的表达和活性，抑制细胞凋亡，发挥对脑缺血再灌注损伤有神经保护作用[20]。本研究结果显示，与假手术比较，模型组大鼠皮层和海马中组织蛋白酶B和组织蛋白酶D蛋白表达均明显升高，而生姜挥发油可明显降低脑缺血再灌注大鼠皮层和海马中组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的蛋白表达，提示生姜挥发油的抗凋亡作用可能与降低组织蛋白酶B和组织蛋白酶D的蛋白表达有关。

本研究为生姜挥发油保护脑缺血再灌注损伤提供了有力的理论支持，阻止溶酶体-线粒体途径的凋亡可能是生姜挥发油防治脑卒中神经损伤的新视角，尚待更深入的研究。

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