海马体是大脑边缘系统的重要组成部分，位于内侧颞叶深处，大脑两侧各有1个[1,2]。它在认知功能(即学习和记忆)、情绪调节和情感行为中发挥着重要作用，并与许多神经、精神系统疾病的发生密切相关[3,4,5,6,7]。因此，体外原代海马神经元的培养是一种非常有价值的体外实验模型，与体内实验研究并行使用[8]。原代海马神经元一般取自于动物脑组织，其在形态学和生理功能上都能较好地模拟动物体内细胞，得出真实可信的实验结果。与神经元细胞系相比，原代神经元能够提供更准确的生物学信息，并且具有机体干扰少、影响因素单一及结果容易分析等优点。因此，神经元原代培养常被用于细胞生物学、分子生物学、病理学、生理学以及神经元突触之间相互作用等研究[9,10]。

目前，诸多学者在实验中进行了原代神经元的提取、培养等实验操作，方法多样，其中神经元的接种密度、培养基的选择和营养因子的使用情况等各不相同。我们参考大量国、内外原代海马神经元培养方法并进行实验[11,12,13,14,15],对现有的原代培养方法进行改良。分离胎鼠海马和皮层，以多聚赖氨酸作为神经元体外培养的生长基质；运用单一的0.125%胰蛋白酶进行消化(CO2培养箱孵育10～15 min);以低密度1.4×107/L将海马神经元铺于12孔培养板中心，将略高密度2×108/L的皮层细胞铺于周围；培养基成分为Neurobasal培养基+2%B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺；培养时不换液，利用皮层细胞所释放的因子为海马神经元提供营养成分，从而获得纯度高，稳定性好及体外存活时间长的海马神经元。这一胎鼠原代海马神经元体外培养方法，可为神经系统中海马神经元相关疾病研究，提供良好的海马神经元体外培养模型。

1、材料和方法

1.实验材料

1.1实验动物：

孕16～18 d SD雌性大鼠，由扬州大学实验动物中心提供，经江苏省科学技术厅审批，动物生产许可证号为SYXK(苏)2017-0044。大鼠饲养于扬州大学无特定病原体的动物实验屏障系统中，12 h光暗交替，温度(22±2)℃,湿度(50±5)%,自由饮水和摄食。所有实验程序均经扬州大学动物伦理委员会审批。

1.2主要试剂：

Neurobasal培养基(Gibco公司);DMEM/F12(1∶1)培养基和马血清(Gibco公司);DMEM高糖培养基(Hyclone公司);D-Hanks溶液(Hank’s Balanced Salt Solution,武汉博士德生物工程有限公司);谷氨酰胺(Sigma公司);B27培养基神经生长因子(Gibco公司);0.25%胰蛋白酶(无EDTA,Gibco公司);阿糖胞苷(Sigma公司);兔抗微管相关蛋白2(microtubule associated protein-2,MAP2)单克隆抗体(Abcam公司);Alex Fluor 488结合 驴抗兔和Alex Fluor 594结合驴抗大鼠抗体(Thermo Fisher公司),CCK-8试剂盒和DAPI染色液(上海碧云天生物技术有限公司),荧光保存试剂(Merck公司),异氟烷(瑞沃德生命科技有限公司)。

1.3实验器具和仪器：

手术器具：眼科剪、手术剪、眼科镊和200目细胞筛、10.0 mm×10.0 mm盖玻片；15 ml离心管、12孔细胞培养板、24孔细胞培养板、30 ml安瓿瓶、10 cm培养皿和6 cm培养皿。实验仪器：倒置荧光显微镜(德国Leica公司);倒置相差显微镜(日本Olympus公司),体视显微镜(德国Leica公司);CO2细胞培养箱(美国Thermo Fisher公司);超净工作台(苏州净化设备有限公司);多功能酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司);通用型小动物麻醉机(瑞沃德生命科技有限公司)。

2.实验方法

2.1细胞盖玻片及培养板的预处理：

将新购置的10.0 mm×10.0 mm盖玻片用双蒸水冲洗干净并烘干后，浸于配制好的酸缸(H2SO4)中过夜，随后再次经双蒸水冲洗干净、烘干，高压灭菌备用。将上述高压好的细胞盖玻片置于12孔培养板中央，在盖玻片上及其周围一圈滴加浓度为0.1 g/L的多聚赖氨酸包被液，37℃孵育1～2 h后吸去包被液，用无菌0.1 mol/L PBS洗3次，待用。

2.2原代海马神经元的培养

2.2.1分离海马：

将孕16～18 d SD大鼠置于具有异氟烷麻醉剂的通用型呼吸麻醉机箱体中进行麻醉，待大鼠麻醉后，将麻醉机调节为面具模式，同时将浓度刻度调至2.5,进行维持麻醉。孕鼠经75%乙醇消毒腹部皮肤后，开腹取出胎鼠，观察胎盘的完整性及胎鼠生长状况。取出胎鼠放入装有预冷D-Hanks溶液的培养皿中。去除胎鼠头部皮肤和颅骨，小心完整地将全脑取出置于另一个含有预冷D-Hanks溶液的培养皿中。在体视显微镜下完全剥去脑膜和脉络丛，随后分离左、右两个大脑半球，小心取出海马和皮层，置于含有预冷DMEM高糖培养基的培养皿中。

2.2.2消化和离心：

用眼科剪分别将分离出的海马和皮层剪碎，经1 ml移液枪反复、缓慢吹打10次。静置2 min后，吸取上清液于新的培养皿中，并加入1 ml预冷的DMEM高糖培养基，再次缓慢吹打组织10次，静置2 min,不断重复上述操作，至几乎无组织块(上述过程全部在冰上完成)。随后，边摇晃边加入与培养基等体积的0.25%胰蛋白酶溶液(使胰蛋白酶溶液稀释为0.125%胰蛋白酶溶液),将两部分细胞均置于37℃孵箱中消化10～15 min,期间每隔5 min缓慢吹打几次以便充分消化。最后，用含有马血清的培养基终止消化，并用200目的细胞筛进行过滤，获得的细胞悬液在1000 r/min下离心5 min后弃上清，加少量种植培养基(DMEM/F12+10%马血清)重悬细胞。

2.2.3海马神经元的接种：

在利用种植培养基(含10%马血清的DMEM/F12)重悬细胞沉淀后，计数细胞数目，根据实验目的调整细胞密度，将海马神经细胞悬液稀释至1.4×107/L后接种于12孔培养板中央的玻片上；另将皮层细胞悬液稀释至2×108/L,呈圆环状匀速绕圈接种在玻片周围。细胞接种完成后置于37℃、5%CO2孵箱中培养。

2.2.4海马神经元的换液：

接种细胞4～6 h待细胞完成贴壁后，更换培养基为维持培养基(Neurobasal培养基+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺),并在培养基中加入5μmol/L阿糖胞苷以抑制胶质细胞和非神经细胞生长，随后不更换培养基对细胞进行继续培养。

2.3海马神经元生长形态观察：

在倒置相差显微镜下观察海马神经元1 d、3 d、5 d、7 d、14 d和21 d的形态学变化，并摄片记录不同时间海马神经元的生长情况和突触神经网络的形成状况。

2.4海马神经元活性检测：

将细胞悬液以每孔1×103个细胞量接种于96孔培养板中(100μl),采用CCK-8试剂盒检测培养不同时间的海马神经元的活性，经酶标仪检测发射波长450 nm下各孔的吸光度(absorbance, A)值，以细胞活力为纵坐标绘制海马神经元生长曲线。

2.5海马神经元的纯度鉴定：

用37℃0.1 mol/L PBS漂洗神经元2次，然后用4%多聚甲醛固定海马神经元30 min。固定后用0.1 mol/L PBS洗海马神经元5 min×3次。对神经元进行通透+封闭处理30 min(1.5%驴血清，0.1% Triton X-100)后，在兔抗MAP2抗体(1∶500)中4℃下过夜，次日用0.1 mol/L PBS漂洗海马神经元5 min×3次，加入二抗Alex Fluor 488结合的驴抗兔抗体(1∶500),室温孵育2 h后，加入DAPI染色5 min, 0.1 mol/L PBS漂洗5 min×3次后，进行防淬灭封片。光学显微镜下摄片，统计MAP2阳性细胞比率。

2.6统计学分析：

采用SPSS 22.0统计学软件进行分析。正态分布的计量数据以均值±标准差

表示，组间两两比较采用单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结 果

1.海马神经元提取结果

在通过母鼠阴道栓确认胎鼠胎龄后，完整取出胎鼠并观察胎鼠体长等身体特征，以确保实验一致性。图1为海马神经元的提取过程，提取全程保持低温(冰浴),全程不超过3 h,时间过久会影响神经元的纯度及成活率。首先将取出的胎鼠由75%乙醇消毒后放在装有预冷D-Hanks溶液的培养皿中。去除胎鼠头部的皮肤和颅骨，可清晰地暴露出光滑、柔软具有脑膜的脑组织，轻柔地将全脑小心完整取出并转置于另一预冷D-Hanks溶液中。随后进行脑膜和脉络丛的剥离，由于两者的剥离程度直接影响后续神经元的提取纯度，我们选择在体视显微镜下将几近透明的脑膜和脉络丛完全剥离(图1A)。分离出弯曲、条状的海马及边缘皮层置于预冷DMEM(高糖)培养基中(图1B,1C)。随后在培养皿中加入胰蛋白酶溶液进行消化处理，将培养皿放入37℃孵箱孵育10～15 min,期间每隔5 min进行1次缓慢吹打。如此操作，可以极大程度地提高原代海马神经元纯度，并为后续神经元培养的存活率提供一定的保证。

2.海马神经元形态学观察

原代海马神经元培养1 d时，可见大部分细胞已经完成贴壁且密度、分布较为均一。神经元胞体较为饱满，呈球形或类球形，周围有光晕，稍有立体感，折光性较强。其中，少量细胞已经长出3～4个突起，长短不一，但与相邻突起之间尚无连接(图2A1)。 培养3～5 d时，海马神经元突起明显变长，呈放射状，胞体明显增大，多为圆形，表面光滑，折光性变强，此时可见较多突起相互连接成稀疏网络(图2B1,2C1)。培养7～21 d时，神经元胞体丰满，开始聚集，光晕明显，突起增粗、变长并连接成错综复杂的神经网络，海马神经元已生长的比较成熟(图2D1～2F1)。与培养天数相同的共培养神经元相比，低密度1.4×107/L接种的单一海马神经元生长速度缓慢，细胞稀疏易死亡(图2A3～2C3);而以5×108/L密度接种的海马神经元可以生长，但后期细胞密度过高，导致神经元易聚团，影响树突等结构的镜下观察，甚至引起神经元死亡(图2A2～2F2)。

3.海马神经元生长曲线

通过CCK-8试剂盒检测海马神经元的生长状态，可以看到细胞生长状态良好，并且随着培养时间的延长，细胞活力在2～4 d内呈显著上升，随后上升逐渐变缓，至14 d时达最高峰，而14 d后细胞活力开始逐渐降低。由此我们可以认为，在7～14 d内神经元活力较高，成活率较好，而其存活率最高的时间为14 d (图3)。由此我们可以根据不同实验而选择合适的细胞培养和使用时间。

4.海马神经元的纯度鉴定

MAP2是一种细胞骨架蛋白，主要存在于神经元中，胶质细胞不表达，与神经元的分支能力相关。因此，在本实验中作为神经元特异性标志蛋白，可用于神经元的鉴定。待神经元发育成熟后(14 d),用MAP2 / DAPI对神经元进行免疫荧光双重染色，以鉴别神经元的性质及纯度[16,17]。取培养14 d的海马神经元进行MAP2和DAPI免疫荧光双重染色，以鉴定神经元纯度。可以看到，神经元具有饱满的圆球状胞体和粗大的突起，其中交错的突起形成了错综复杂的神经网络，MAP2阳性的细胞体、树突呈绿色(图4A),DAPI染色的神经元细胞核为蓝色(图4B),叠加后可见大部分绿色神经元胞体与蓝色胞核呈重叠状态。利用Image J 1软件的自动细胞计数功能，对绿色的胞体及蓝色的胞核进行计数，胞体与细胞核数量的比值计为MAP2阳性细胞百分率，经计算神经元纯度可达98%(图4C)。在倒置荧光显微镜下，用油镜(100×)观察成熟神经元的生长状态，可见原代海马神经元胞体在7 d、14 d和21 d时逐渐增大，且神经元轴突较为粗壮，其中14～21 d较为明显(图4E～4F白色箭头所指位置)。

图1海马神经元提取步骤  

图2不同培养时间、密度下海马神经元的形态标尺示100μm

图4海马神经元观察及鉴定  

图3海马神经元活力变化(n=5)   

3、讨 论

近年来，大量研究表明，海马结构早期的变化与癫痫、缺血性脑卒中、阿尔茨海默病等神经系统疾病的病理、生理过程相关[18,19,20]。相较于细胞系而言，原代海马神经元更加拟合于动物体内细胞。因此，提取、培养高质量的原代海马神经元具有十分重要的意义。原代海马神经元直接取自动物海马，目前主要来自于大鼠的胎鼠或新生鼠。在神经元的培养过程中，高神经元活性和高存活率是培养成功的关键条件。目前，诸多学者尝试过多种原代海马神经元的培养方法，如使用无血清培养基、含有血清培养基以及两者交替使用；另外，在去除杂质细胞的问题上也具有一定争议。有学者认为，在神经元的培养过程中应该加入阿糖胞苷以达到对其他非神经细胞的抑制；而另一些学者认为，加入阿糖胞苷会严重影响到神经元的存活数量及质量，因而采用含有B27的无血清培养基对细胞进行纯化培养。此外，还有关于细胞接种密度及胰蛋白酶使用浓度等诸多争议。在检索了国内、外大量文献的基础上[12,13,14,15],本研究对以往的培养方法进行了以下总结与改进，期望可为后续进行神经元相关疾病研究奠定基础。

1.取胎鼠海马并对培养板进行多聚赖氨酸包被

大鼠胎鼠海马神经元成活率高，因此为获得高纯度、高稳定性的原代海马神经元，我们选择将大鼠胎鼠的海马作为原代海马神经元提取来源。由于原代海马神经元不易贴壁，为使原代海马神经元更好地贴于孔板上，我们对12孔细胞培养板和玻片进行了预处理，用0.1 g/L的多聚赖氨酸包被1～2 h。与未包被培养板相比，多聚赖氨酸包被的培养板中神经元贴壁数量更多，证明此方法可明显提高神经元的成活率。

2.分离全程在体视显微镜下操作

脑膜和脉络丛的剥离程度与提取神经元的纯度息息相关。为获取纯度更高的神经元，我们在体视显微镜下进行脑膜和脉络丛的完全剥离。与肉眼直接操作相比，体视显微镜下操作更加容易、直观，脑膜和脉络丛的剥脱更为干净，也便于我们剥离其周围粘连的脑膜、微血管及边缘其他脑组织。同时，在镜下操作有助于我们快速准确地找到海马并明确其范围，更容易获得完整、干净的海马，从而使细胞纯度和产率从源头得到保障。此外，我们可以在提取海马前，先进行左右大脑半球的分离，这也有利于我们明确海马具体位置及其轮廓，便于海马的提取。随后，将提取的海马置于预冷DMEM(高糖)培养基中。整个操作过程均在体视显微镜下、生物安全柜中完成。海马神经元提取完成后，我们用同样方法完成皮层细胞提取。

3.使用0.125%胰蛋白酶(不含EDTA)消化

细胞的消化方式在一定程度上决定了细胞存活率。相比机械分离法，酶消化法作用更为缓慢、温和，对神经元损伤更小。因此，本实验选择采用酶消化法对细胞进行处理。过去许多学者选用胰蛋白酶加DNA酶I对细胞进行消化，其中的微量DNA酶I可以降低消化时液体的黏稠度，减少胶冻样物，提高细胞产率，但其对原代神经元具有潜在毒性，易降低神经元的存活率。因此，我们选择使用单一胰蛋白酶制备神经元单细胞悬液，酶浓度为0.125%胰蛋白酶且不含EDTA。另外，单一胰蛋白酶消化法的时间通常控制在10～15 min,时间过短消化不够充分，可能导致后续吹打过程剧烈而损伤神经元；而消化时间过长会直接伤害细胞，导致存活神经元数量减少。

4.低密度海马神经元与皮层细胞共培养

在原代神经元的培养过程中，细胞的接种密度是其中十分关键的步骤，与海马神经元存活率及其提取纯度密切相关。接种密度过高容易导致成纤维细胞及胶质细胞的快速、大量增生，也容易使细胞聚集成团，发生接触抑制，不利于海马神经元分化、成熟；接种密度过低会导致神经元不易成活。目前大多数研究所采用的接种密度为2×105/cm2～1×106/cm2,经过反复实验，本研究以低细胞密度同时接种海马和皮层两部分细胞的方式进行共培养，其中海马神经元以1.4×107/L密度接种于中央，在外周以2×108/L密度接种皮层细胞，以该密度所培养的神经元发育状态良好，成活率高。

5.采用Neurobasal培养基+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺的培养基体系

培养基作为神经元的生长环境，其选择直接关乎到细胞的生长状态。我们采用Neurobasal培养基+2% B27+0.5 mmol/L谷氨酰胺的培养基体系，通过验证发现，此培养基为目前最佳的培养基，具有诸多优点：(1)Neurobasal培养基是一种可同时满足胎鼠和成体脑神经元培养的特殊基础培养基，可以维持神经细胞的长期生长及其正常表型，同时能满足神经元高纯度培养的目的；其不含血清，成分构成清楚，能够更好地控制实验条件一致性，利于研究特定因素对体外培养原代海马神经元的影响。此外，无血清培养液可以使神经元细胞的生长环境更接近正常生理状态；(2)在该培养基中加入B27神经生长因子，B27中含有谷酰胺、转铁蛋白、胰岛素、黄体酮等细胞生长所必须的因子，是血清的良好替代物，还含有多种抗氧化剂和微量元素，具有保护神经细胞的作用[13]。

综上所述，本实验通过汲取、优化前人原代海马神经元的培养方法，得到一种低密度、高纯度的胎鼠原代神经元培养方法。该方法简单易行，所得细胞纯度高，生长状态好，体外存活时间长，可为缺血性脑卒中等海马神经元相关疾病的研究提供良好的体外培养模型。

参考文献:

[3]李晓明,韩芳,石玉秀.线粒体凋亡路径参与创伤后应激障碍大鼠海马神经元凋亡的调控[J].解剖学报,2010,41(2):201-205.

[11]季凤清,岳旭,孙海梅,等.缺氧复氧致神经细胞凋亡中Bcl-2､Bax基因蛋白的表达[J].解剖学报,2001(4):338-342,399.

[14]吴倩,穆婷婷,汪宁.一种乳鼠海马神经元原代培养方法的优化与鉴定 [J].中医药临床杂志,2021,33(5):923-926.

基金资助:江苏省研究生科研与实践创新计划项目(KYCX22_3562); 中国博士后科学基金(2022M712689);

文章来源:苏芃,王兴仪,梁景岩等.一种低密度及高纯度胎鼠原代海马神经元培养方法的优化及鉴定[J].解剖学报,2024,55(01):113-119.