目前越来越多的证据表明，肠道菌群参与了慢性肾脏病的进展以及并发症的发生，包括肠屏障功能的维持，而慢性肾脏病(Chronic renal disease, CKD)状态下肠道菌群发生了明显的失调[1],在早期CKD患者中就可以观察到肠道细菌的定量和定性发生变化[2]。因此，肠道菌群的变化与肠屏障功能息息相关[3]。在CKD中恢复肠道菌群的共生关系，减少尿毒症毒素、氧化应激和炎症的产生很有必要[4]。缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的破坏可导致紧密连接蛋白表达的降低和肠上皮通透性的增加，因此防止HIF-1α的降低可能是维持上皮屏障功能的一种潜在途径[5,6]。罗沙司他是一种用于稳定HIF的脯氨酸羟化酶抑制剂，既往研究[7]多是在治疗肾性贫血方面，而罗沙司他对CKD状态下肠屏障功能的影响目前尚少有研究。因此，本研究探究罗沙司他是否可以改善CKD肠屏障功能，明确罗沙司他调控肠屏障功能的机制，为罗沙司他在肠道保护方面的应用提供科学依据。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级(无特殊病原体)成年健康雄性SD大鼠，体重180～220 g,购买于西安交通大学医学院动物实验中心[SCXK(陕)2018-001]。所有动物实验均遵照国家实验动物饲养与使用指南。饲养于清洁级实验动物中心动物饲养室，12 h明暗循环，所有大鼠给予普通标准颗粒饲料喂养，自由摄食和饮水，温度(25±2)℃,湿度50%～70%。本研究严格遵守实验动物保护和使用指南的标准，经西安交通大学医学院实验动物伦理委员会批准(项目号：XJTULAC2019-1274)。

1.2实验试剂及药物

罗沙司他(珐博进医药技术开发有限公司，中国)溶液配置：低剂量溶液，150 mg胶囊内粉末，加入双蒸水，定容至20 mL;高剂量溶液，150 mg胶囊内粉末，加入双蒸水，定容至15 mL,现配现用。大鼠IL-6、TNF-α、铁调素ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。HE染液、Masson染液套装购自武汉Servicebio公司。16SrRNA测序所需DNeasy PowerSoil Kit、QIAamp 96 PowerFecal QIAcube HT kit(德国QIAGEN公司)、Qubit dsDNA Assay Kit(美国Thermo Fisher Scientific公司)、Tks Gflex DNA Polymerase(日本Takara公司)。

1.3方法

采用5/6肾切除术构建CKD大鼠模型，检测肾功能确定造模成功后分组给予高低剂量罗沙司他灌胃；给药后检测Scr、BUN及Hb;收集肾脏标本，用HE和Masson染色观察肾脏病理表现；ELISA法检测血清炎症因子TNF-α、IL-6和血清铁调素水平；对大鼠粪便样本进行16S rRNA微生物组测序，分析肠道微生物组成改变。

1.3.1建模及分组

选取SPF级SD大鼠22只，自由饮水和摄食，适应性饲养1周，适应动物房环境并且无异常发现后开始建立动物模型。大鼠随机先分为假手术组(Sham组，n=4)、肾切组(5/6肾切除，n=18)。肾切组大鼠以2%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔注射麻醉后，常规固定、消毒。首先在左侧肾区作一长约2 cm的纵行切口，暴露左肾并分离肾周脂肪囊，分离出肾动脉及其分支，切除2/3肾组织，逐层缝合切口。一周后右肾区作一长约2 cm纵行切口，暴露右肾分离出右肾蒂，结扎并摘除右肾。Sham组只进行血管分离而不进行结扎或右肾切除。术后各组大鼠自由饮水摄食。20周后各组大鼠眼内眦静脉采血测定大鼠肾功能及血红蛋白，评估肾切组大鼠模型构建情况。评估过肾切组模型成功后，将肾切组大鼠随机分为CKD组(n=6)、CKD+罗沙司他低剂量(7.5 mg/kg, tiw)灌胃组(CKD-LOW组，n=6)、CKD+罗沙司他高剂量(10 mg/kg, tiw)灌胃组(CKD-HIGH组，n=6)。每周1、3、5固定时间进行大鼠灌胃，共6周。Sham组及CKD组大鼠同时灌胃双蒸水1 mL。

1.3.2血清及肾脏组织标本采集与检测

2%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，取材并处死大鼠。标本采集过程严格无菌操作。腹主动脉采血：大鼠麻醉后仰位固定，打开暴露腹腔，将肠管移开，用纱布擦拭分离腰椎旁的脂肪，即可见腹主动脉。以动脉夹夹住近心端，选取5 mL注射器刺入，用镊子夹住针头，松开动脉夹，即可抽血。根据大鼠的体重可采至少6～10 mL血。委托金域医学检测各组大鼠血红蛋白、尿素氮和肌酐水平。血红蛋白采用比色法检测、尿素氮及肌酐均采用酶法检测。采用ELISA检测IL-6、TNF-α、铁调素水平。按照试剂盒说明书操作。逐层打开腹腔，充分暴露一侧肾脏，以缝线结扎肾蒂后摘取肾脏。取2 cm×0.2 cm×0.2 cm肾组织以4%多聚甲醛固定，4℃固定过夜，后包埋成石蜡标本，后续对蜡块进行切片，行HE及马松三色(Masson)染色。剩余肾脏组织置于冻存管内，标记后置于液氮(-190℃)中冻存过夜，后转存于-80℃冰箱中长期保存用于后续实验。

1.3.3蛋白免疫印迹(Western Blotting)

肾组织(40μg)在含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液中冰上匀浆，4℃离心，取上清提取总蛋白。用BSA测定试剂盒(USA)测定蛋白质浓度后，每个样品的等量蛋白质用10% SDS-PAGE在70 V下分离30 min,然后用110 V分离到底。将分离蛋白转移到PVDF膜(Millipore, USA)上。将PVDF膜与一抗(Abcam Technology, UK:TGF-β1,1:10 00;α-SMA,1:10 00;β-actin, 1:2000)在4℃下孵育过夜，然后与相应HRP标记的二抗在室温下孵育1 h。用化学发光(ECL)检测系统(Pierce, Rockford IL,USA)检测蛋白含量。检测到的蛋白浓度以β-actin的比值表示。采用ImageJ软件分析印迹浓度。

1.3.4粪便标本采集及基因组DNA提取

2%戊巴比妥钠溶液(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，取材并处死大鼠。标本采集过程严格无菌操作。在暴露的腹腔组织中，找到回盲部，向下找到结肠，从直肠上面的结肠中取出1～2粒大鼠粪便，置于无菌冻存管内，标记后置于液氮(-190℃)中冻存，后转存于-80℃冰箱用于后续实验。采用DNA抽提试剂盒对样本的基因组DNA进行提取，之后利用琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop2000检测DNA的浓度。以基因组DNA为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode的特异引物，Takara公司的Tks Gflex DNA Polymerase进行PCR,确保扩增效率和准确性。细菌多样性鉴定对应区域：16S V3-V4区(引物343F和798R)。PCR产物使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后作为二轮PCR模板，并进行二轮PCR扩增，并再次使用电泳检测，检测后使用磁珠纯化，纯化后对PCR产物进行Qubit定量。根据PCR产物浓度进行等量混样，并上机测序。引物序列，见表1。

表1引物序列

1.3.5信息分析流程

将以上步骤得到的扩增产物定量混样，在Illumina NovaSeq 6000设备上机测序，得到原始测序序列。原始数据以FASTQ格式存储。使用Trimmomatic软件对原始双端序列进行去杂。去杂参数为：检测并截去模糊碱基N;使用滑窗法检查平均碱基质量，当质量低于20时，截取前面高质序列。去杂后的双端序列利用FLASH软件进行拼接，参数为：最小的overlap为10 bp、最大的Overlap为200 bp、最大错配率为20%。为保证结果的准确性，可进行精准去杂，去除含有模糊碱基、单碱基高重复区的序列以及长度过短的序列。精准去杂的参数为：去掉含有N碱基的序列，保留碱基质量分数Q20达到至少75%的序列。同时，利用UCHIME检测并去除序列中的嵌合体序列。测序数据进行预处理生成优质序列之后，采用Vsearch软件，根据序列的相似性，按照97%的相似度进行OTU分类，并选取每个OTU中丰度最大的序列作为该OTU的代表序列，采用RDP classifier Naive Bayesian分类算法对代表序列与数据库进行比对注释，得到OTU的注释信息。16S使用Greengenes或者Silva(version123)数据库比对，保留置信区间大于0.7的注释结果。按照最小深度对所有样本随机抽取，完成数据的均一化处理，得到抽齐后的OTU表格。统计各样本中微生物群落在各分类水平，包括kingdom(界)、phylum(门)、class(纲)、order(目)、family(科)、genus(属)、species(种)的组成与丰度。根据聚类结果，对粪便菌群进行物种多样性(α多样性、β多样性)、物种分类学组成、差异物种筛选、代谢功能预测等进一步分析。

1.4统计学分析

本研究资料采用SPSS 26.0软件处理。对于参数分布的样本，结果以均值±标准差

表示，两样本均数之间采用独立样本t检验进行比较，多组样本均数之间采用ANOVA方差分析，多组内样本两两之间差异采用LSD-t检验。将数据输入GraphPad Prism 8.0软件，绘制柱状图。以P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1一般情况

CKD组大鼠出现多尿、多饮，精神萎靡，并逐渐出现食物摄入量明显减少，体重下降、体重增长缓慢，毛发竖立、毛色干燥、枯黄无光泽，口唇颜色苍白，目色淡红，耳廓湿冷，性情淡漠、易激、身体蜷缩、活动度减少等。5/6肾切除慢性肾脏病模型建立及给药过程中大鼠死亡4只。20周后大鼠眼内眦静脉取血检测肾功能，大鼠血BUN、SCr是对照组的2～3倍即判定为造模成功。在肾切组模型成功的基础上，构建罗沙司他给药组模型。

2.2各组大鼠肾功能及Hb检测结果

与Sham组相比，其他3组大鼠Scr及BUN水平显著增高(P<0.05);CKD-HIGH组大鼠的BUN、SCr水平低于CKD-LOW组(均P<0.05);CKD-HIGH组大鼠的BUN、SCr水平低于CKD组，但差异无统计学意义(P>0.05);与Sham组相比，CKD组大鼠Hb显著降低，CKD-LOW组及CKD-HIGH组大鼠Hb较CKD组均显著升高(P<0.05),CKD-LOW组及CKD-HIGH组Hb差异无统计学意义(P>0.05)。见图1。

图1各组大鼠给药后肾功能及血红蛋白  

2.3肾脏组织病理学改变

CKD组肾脏组织发生明显病理改变，肾小球结构紊乱、肾小球硬化、系膜增生、肾小管广泛扩张、肾小管上皮细胞脱落、肾间质纤维化、大量炎症细胞浸润；CKD-LOW组也发生了病理改变，但是其肾小球硬化及肾间质纤维化的程度明显轻于CKD组；CKD-HIGH组的病理改变最轻，肾小球硬化、肾间质纤维化及肾小管扩张的程度进一步降低(见图2A)。蛋白免疫印迹结果显示CKD组大鼠肾间质纤维化指标α-SMA, TGF-β1表达显著增加(P<0.001),CKD-LOW组和CKD-HIGH组的表达则显著被抑制(P<0.01),见图2B。

2.4血清炎症因子及铁调素检测

与Sham组相比，CKD组血清IL-6、TNF-α、血清铁调素水平均显著升高，CKD-HIGH组IL-6、TNF-α较CKD组显著降低(均P<0.05);CKD-LOW组IL-6较CKD组显著降低(P<0.05),TNF-α仅有降低趋势(P>0.05);CKD-LOW组与CKD-HIGH组间IL-6、TNF-α水平差异无统计学意义(P>0.05);CKD-HIGH组和CKD-LOW组较CKD组血清铁调素水平显著降低(均P<0.05),CKD-HIGH组和CKD-LOW组组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

2.5 16S rRNA测序结果

2.5.1肠道菌群OUT聚类分析

各组肠道微生物组成具有显著差异，4组样本共有376个重叠的OUT,Sham组、CKD组、CKD-LOW组及CKD-HIGH组分别独有202、302、290及64个OUT,见图4。

2.5.2α多样性分析

与Sham组相比，CKD组的PD_whole_tree指数显著升高(P<0.05),而Chao1、Shannon、Simpson指数差异均无统计学意义(P>0.05);其他各组间多样性指数差异均无统计学意义(P>0.05),但是Chao1、Shannon、PD_whole_tree指数在CKD组有相对Sham组的上升趋势，给药组相对CKD组有降低趋势。结果提示罗沙司他对肠道菌群α多样性影响较小。见表2。

图2各组大鼠肾脏组织病理染色及蛋白免疫印迹结果  

图3各组大鼠血清IL-6、TNF-α、铁调素水平  下

图4花瓣图与韦恩图 

2.5.3β多样性分析

PCA分析显示，CKD组和Sham组在PC2水平上呈明显分开，表明CKD组大鼠肠道菌群组成结构较Sham组有改变且差异有统计学意义(P<0.05);而给药后CKD-LOW组及CKD-HIGH组在PC2水平上均偏离CKD组且向Sham组靠近(见图5A)。采用ANOSIM方法分析，基于unweighted unifrac算法，PCoA分析也显示四个组的肠道菌群组成差异有统计学意义(r=0.4232,P=0.001),提示样品组间差异突出而组内的差异性较低，分组效果较好，见图5B。

表2各组大鼠α多样性指数结果

图5β多样性分析 

2.5.4菌落组成分析

在门水平上，各组大鼠肠道菌群包括拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirochaete)、埃普西隆杆菌门(Epsilonbacteraeota)等主要门类。其中，拟杆菌门和厚壁菌门占到菌门的85%以上。各组大鼠肠道菌群中厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为优势菌门，除此以外，CKD-HIGH组螺旋体门丰度较大，其余组别埃普西隆杆菌门丰度较大。CKD组厚壁菌门比例较Sham组升高，拟杆菌门比例下降，厚壁菌门与拟杆菌门比值(Firmicutes/Bacteroidetes, F/B)也呈上升趋势，CKD-LOW及CKD-HIGH组，F/B值进一步上升。见图6。

图6各组厚壁菌门与拟杆菌门比值  

在属水平上，各组大鼠肠道菌群主要包括普雷沃氏菌属(Prevotella-9)、拟杆菌属(Bacteroides)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、拟普雷沃氏菌属(Alloprevotella)、毛螺菌属(Lachnospiraceae)、瘤胃球菌属(Ruminococcaceae)、玫瑰菌属(Roseburia)等。优势菌属为普雷沃氏菌属、拟杆菌属、乳酸杆菌属及Alloprevotella菌属。用T test算法统计组间差异显著性的物种。与Sham组相比，CKD组共0个门、0个纲、3个目、6个科的物种丰度存在显著性差异(均P<0.05);共19个属存在显著差异，其中相对丰度靠前的片球菌属(Pediococcus)、果胶杆菌属(Pectobacterium)、Ruminiclostridium_5菌属在CKD组降低(均P<0.05);而Coprococcus_3菌属、弧菌属(Vibrio)、消化球菌属(Peptococcus)、里克内拉菌属(Rikenella)、Delftia菌属等在CKD组富集。与Sham组相比，相对丰度靠前的属中有3个菌属在CKD组中丰度降低，且经罗沙司他干预后，丰度升高(均P<0.05),包括Pediococcus、Pectobacterium和Blautia菌属；有3个菌属在CKD组中丰度升高，经罗沙司他干预后，丰度降低(均P<0.05),包括弧菌属、Delftia菌属和Pseudomonas菌属。见图7。

图7组间差异显著的菌种  

3、讨论

在CKD状态下，肠道菌群紊乱产生多种代谢毒素，通过受损的肠道屏障进入循环，促进心血管和肾脏损害，进一步加剧CKD进展，与临床不良预后密切相关。基于肠与肾的这些联系， “肠-肾轴”理论形成。肠屏障是该理论的关键环节之一，目前对于CKD肠屏障损伤的治疗尚少研究[8]。据文献[9]报道，HIF-1α信号传导对维持肠道屏障和免疫反应具有重要作用，而用于稳定HIF-1α的脯氨酰羟化酶抑制剂和低氧诱导因子脯氨酰羟化酶2(HPH-2)抑制剂已被证明在几种炎症性肠病模型中具有保护作用。由于CKD肠屏障损伤和炎症性肠病表现的相似性，认为脯氨酰羟化酶抑制剂罗沙司他或许也具有肠屏障保护作用。为验证这一假设，我们构建了CKD大鼠模型并进行了罗沙司他给药。

本研究中罗沙司他高剂量给药组大鼠的BUN、SCr与CKD组相比有降低趋势；在肾脏组织病理图片上也可以发现同样的结果，肾切组大鼠肾脏组织均有肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管扩张等病理改变，但是CKD组病理改变最重，而罗沙司他高剂量给药组最轻，各组TGF-β1、α-SMA表达趋势与病理改变一致，这提示罗沙司他或许可以延缓CKD进展。目前已有文献[10]报道了HIF-PHDs抑制剂在急性和慢性肾脏疾病中的作用：罗沙司他预处理可以激活HIF-1α和核因子红细胞2相关因子2(Nrf2),减少叶酸诱导的急性肾损伤早期的铁死亡，并延缓纤维化进展；在缺血再灌注诱导的急性肾损伤小鼠模型中，罗沙司他预处理通过减弱炎症反应显著缓解肾损伤；在腺嘌呤诱导的肾病模型中罗沙司他也有类似的减毒作用，这与我们的结果一致。

炎症因子的异常表达可破坏肠道内局部免疫的平衡，激活肠黏膜固有层淋巴细胞，引起促炎因子如TNF-α等的生成增加，部分炎症因子又可促进其他炎性介质的释放，进一步引起或加重肠道炎症反应及肠组织破坏。HIF通路能激活免疫细胞中的适应性反应，对炎症期间上皮和免疫细胞的功能和发育产生强烈影响[11]。HIF-1α在所有免疫细胞中都有表达，而HIF-2α的表达模式仅限于几种亚型。据报道[12],HIF-1α能直接调节类风湿性关节炎滑膜成纤维细胞中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的产生；葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中，HIF-1α的缺失增加IL-6和IL-23的产生，导致肠道炎症加重[13];而羟化酶抑制剂可通过稳定HIF-1α显著降低结肠炎小鼠模型疾病严重程度和炎症标志物IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α的水平。本研究结果表明罗沙司他可降低CKD大鼠血清炎症因子的水平，改善微炎症状态，或可有益于CKD肠道健康。

铁调素[14]在炎症性贫血的发病机制中起关键作用，并且由于肾脏清除率降低和尿毒症物质的存在，在CKD患者中升高[15];本研究中同样发现在给予罗沙司他后，高低剂量组血清铁调素呈剂量依赖性降低，提示罗沙司他可以明显降低循环铁调素浓度，改善铁代谢，且与给药剂量有关。研究[16]发现，CKD患者的双歧杆菌科定植率较低，主要是双歧杆菌、乳杆菌科、拟杆菌科和普氏菌属，而肠杆菌科的肠道水平较高，尤其是肠杆菌、克雷伯氏菌和埃希氏菌，肠球菌和产气荚膜梭菌的水平也升高。本研究发现，与假手术组相比，CKD组大鼠α多样性有差异变化，代表菌群丰富度及多样性的Chao1、Shannon、PD_whole_tree指数呈上升趋势，尽管统计学差异不显著，可以看出CKD组大鼠肠道菌群存在过度生长态势。而给予罗沙司他干预后，以上各项α多样性指数出现了下降趋势。提示CKD组肠道菌群物种多样性增加，罗沙司他给药限制了这种变化；而也有一些研究发现CKD时肠道菌群的丰富度及多样性降低，出现差异可能与不同研究的样本量、菌群检测方法及环境的影响等有关。进一步分析各组大鼠肠道菌群β多样性发现，CKD组大鼠肠道菌群组成结构较假手术组有显著差异，而罗沙司他给药后菌群组成偏离CKD组且向假手术组靠近。进一步分析各组大鼠肠道菌群物种发现，与假手术组相比，CKD组大鼠门水平、属水平部分肠道菌群组成发生明显变化。如在门水平上，CKD组厚壁菌门Firmicutes比例较假手术组升高，拟杆菌门Bacteroidetes比例下降，F/B数值上升；罗沙司他给药后F/B值仍持续上升。在属水平上，CKD组大鼠肠道菌群组成也发生明显变化。各组大鼠均具有差异性菌属，假手术组的差异菌属多为有益菌；CKD组的差异菌属多为条件致病菌；罗沙司他给药后则有益菌所占比例上升，条件致病菌所占比例下降。在相对丰度排名比较靠前的菌属中，CKD组片球菌属、果胶杆菌属和Blautia菌属较假手术组丰度降低，经罗沙司他干预后，丰度呈不同程度回升；弧菌属、Delftia菌属和Pseudomonas菌属丰度升高，经罗沙司他干预后，丰度呈不同程度降低。以上结果表明，罗沙司他可调控CKD大鼠肠道菌群物种多样性及组成，而上述菌属可能是其主要调控的菌属种类。片球菌属及乳杆菌科，在免疫调节、肠道上皮屏障完整性维持、抗氧化能力方面具有促进健康和预防疾病的功能，根据分类学和物种水平的适当鉴定，片球菌属已被认为是安全的，是益生菌的一种[17]。果胶杆菌属，被认为是有益的[18]。Blautia菌属通过上调肠道调节性T细胞和产生SCFAs,在维持肠道环境平衡和预防炎症方面发挥重要作用[19];研究发现炎症性肠病患者盲肠黏膜菌群Blautia菌属的丰度显著低于正常人。CKD所导致的肠道菌群变化，会增加肠源性毒素的产生并改变肠上皮屏障，进而导致肾损伤过程加速[20]。而罗沙司他给药增加了3种有益菌的丰度，因此我们认为这种改变是有益的。

4、结论

罗沙司他干预能够减轻肾小球硬化、肾间质纤维化、肾小管扩张的程度，或可改善肾脏损伤，延缓CKD进展；降低CKD时升高的血清炎症因子TNF-α和IL-6水平，改善微炎症状态；降低了CKD时升高的铁调素水平，改善铁代谢，改善贫血；同时具有调节CKD大鼠肠道菌群的组成及结构，在属水平上增加片球菌属、果胶杆菌属和Blautia菌属等有益菌的丰度，减少弧菌属、Delftia菌属和Pseudomonas菌属等有害菌的丰度，纠正肠道菌群紊乱状态，从而发挥肠道生物屏障功能保护作用。

基金资助:陕西省重点研发—一般项目—社会发展领域项目(2023-YBSF-477);中华国际医学交流基金会肾性贫血科研基金项目(Z-2017-24-2037);

文章来源:何荃,渠宁,雷子彤等.罗沙司他对CKD大鼠肠生物屏障功能的影响[J].西部医学,2024,36(02):166-174.