随着年龄的增长，人体皮肤的修复能力会逐渐减弱，这一现象在老年人上尤为明显。老年人皮肤伤口常常出现愈合速度慢，愈后结疤瘢等现象，严重减低着老年人的生活质量[1,2,3]。近年来，研究发现间充质干细胞分泌的EGF、FGF2、IGF、PDGF、VEGF、IL-1、IL-10等多种细胞因子能够明显促进伤口愈合，这些细胞因子通过促进细胞增殖、分化、血管生成、抑制炎症反应等几个方面参与皮肤组织生成[4,5]。间充质干细胞分泌因子不仅可绕过与细胞治疗有关的免疫相容性、疾病传染性等问题，还可以批量生产，长期保存，降低细胞培养所需的时间和成本，因此间充质干细胞分泌因子对于创伤、脑缺血、心肌梗塞等疾病的治疗更具优势。但间充质干细胞分泌因子成分复杂，各细胞因子通过何种方式发挥促进老化皮肤创伤愈合的详细调控机制目前尚不可知，这在一定程度上抑制间充质干细胞分泌因子的临床应用。因此，探究真皮间充质干细胞分泌因子治疗老化皮肤创伤的相关分子机制具有十分重要的意义。

成纤维细胞是皮肤创伤中主要的修复细胞，当皮肤发生创伤时，成纤维细胞在多种细胞因子的刺激下，会大量增殖，迁移并分泌胶原蛋白及细胞外基质填补创伤部位，从而达到促进伤口愈合的目的。实验采用卡波姆为凝胶基质，添加富含真皮间充质干细胞分泌因子的条件培养液，制成分泌因子凝胶剂，治疗老化小鼠皮肤创伤，阐明真皮间充质干细胞分泌因子通过激活细胞内ErK1/2信号通路，加快真皮成纤维细胞增殖，促进老化皮肤创伤愈合，不仅为干细胞相关制剂的研发提供技术手段，也为干细胞相关制剂的临床应用提供理论基础。

1、材料与方法

1.1试验动物

试验动物为SPF级野生型129/SvJ小鼠，购自韩国生命工学院。8月龄野生型小鼠12只，雌雄各半，自由饮食，室温控制在25℃左右，12h暗/光周期饲养。所有的动物程序都是按照KRIBB机构动物护理和使用委员会的规定进行的。

1.2主要试剂

苏木精试剂，购买自上海兰秀公司；伊红试剂，购买自天津大茂化学公司；硫酸铁铵、酸性品红、磷钼酸、苯胺蓝试剂，购买自阿拉丁化学公司；高熔点石蜡，购买自德国Leica公司；卡波姆940，购买自麦克林公司；蛋白免疫印迹相关试剂，购买自Amresco公司；PCNA、Cyclin-D1、ErK、p-Erk抗体，购买自美国SantaCruz公司；DMEM，购买自索莱宝公司；胎牛血清，购买自索莱宝公司。

1.3方法

1.3.1小鼠真皮间充质干细胞条件培养基的制备

将真皮间充质干细胞从液氮罐中取出，复苏至10cm细胞培养皿，使用含有10%胎牛血清（FBS）、1%青霉素和链霉素（P/S）的DMEM培养液培养，放入37℃、含5%二氧化碳（CO2）的恒温培养箱中。6h后观察细胞贴壁情况。当细胞生长至细胞融合率达70%～80%时，弃去原来培养液，更换培养液继续培养并加入100μLNEAA以及10μLB27，培养12h后收集真皮间充质干细胞培养上清液，将回收的真皮间充质干细胞上清液以2000rpm，离心10min,0.22μm滤膜过滤去除细胞碎片。即获得真皮间充质干细胞条件培养基，以每管1mL进行分装，储存在-80℃冰箱用于后续实验。

1.3.2卡波姆凝胶剂的制备

首先用电子天平称取0.04g卡波姆加入4mL浓度为0.1mol·L-1的NaOH溶液，再加入11mL蒸馏水，溶胀过夜。第二天呈胶冻状，加入真皮间充质干细胞条件培养基5mL搅拌均匀，进行分装，分装后置于冰箱4℃保存，用于后续实验。

1.3.3老化小鼠皮肤创伤实验

采用8月龄老龄鼠12只，采用0.25%Avertin进行腹腔注射，用于麻醉小鼠，对小鼠背部皮肤5cm×5cm区域进行脱毛处理，先用推子剃去长毛发，再涂抹脱毛膏去除短的毛发，擦去多余脱毛膏，采用酒精、碘伏对脱毛区进行消毒，选取距脊柱1cm的腰后部位置，制作直径为5mm的圆形伤口。分泌因子组小鼠每天定时定量涂抹制作的真皮间充质干细胞分泌因子凝胶，空白对照组小鼠不进行处理，将每只小鼠单笼喂养，自由进食，连续9d拍照观察，对创面面积进行统计学分析。

1.3.4组织切片及H&E染色

组织切片：脱颈处死小鼠，取背部伤口处皮肤1cm×1cm固定于硝酸纤维膜上，按如下流程进行处理，10%福尔马林液固定24h，流水冲洗1.5h，进行脱水处理，70%酒精浸泡40min,80%酒精浸泡50min,90%酒精浸泡1h,95%酒精浸泡1h,100%酒精浸泡1h,100%酒精浸泡1h,100%二甲苯浸泡30min,100%二甲苯浸泡30min,100%二甲苯浸泡1h，高熔点石蜡浸泡30min，高熔点石蜡浸泡30min，高熔点石蜡浸泡1h30min。共计9.5h后对样品进行石蜡包埋，放在冷冻机上将石蜡进行冷冻，去除周围多余的蜡片，将蜡块从包埋盒中起下来，将蜡块修成平整梯形，用切片机先以厚度为10μm进行修片，再以厚度为0.5μm进行切片，于42℃摊片机上摊片，用载玻片将其挑起，室温晾片12h后进行染色。

H&E染色：切片后按照如下流程进行染色处理，100%二甲苯（10min)-100%二甲苯（10min)-100%酒精（1min30s)-100%酒精（1min)-90%酒精（1min)-80%酒精（1min)-50%酒精（1min）-水洗（3min）-苏木精（5min）-水洗（3min)-1%酸酒精（0.2s）-水洗（3min)-0.8%氨水（0.2s）-水洗（5min）-伊红（1min)-95%酒精（1min)-95%酒精（1min)-100%酒精（1min)-100%酒精（30s)-100%二甲苯（30s)-100%二甲苯（30s)-100%二甲苯（1min）。用中性树胶进行封片处理，室温风干12h。用荧光显微镜观察伤口部位皮肤厚度，肉芽组织填充情况，以及上皮组织完整程度，统计学分析皮肤厚度和伤口大小。

1.3.5MTTassay分析

将离心后的真皮成纤维细胞加入培养液，吹打混匀，以1×104个/mL的浓度种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬液，置于5%CO2,37℃恒温培养箱中培养12h后，将空白对照组与真皮间充质干细胞条件培养基组分别更换含2%FBS的DMEM以及之前制备好的真皮间充质干细胞条件培养基，每孔加入100μL。于培养箱中培养24h后，每孔加入10μLMTT，置于培养箱中孵育4h，弃掉培养液后每孔加入100μLDMSO混匀，避光孵育10min，酶标仪检测570nm处的吸光度值，并对所得实验数据进行统计学分析。

1.3.6蛋白质免疫印迹分析

收集细胞置于1.5mL离心管内。每组加入0.05mL细胞裂解液，于冰上裂解，每5min敲打一次，共5次，然后在4℃下8000rpm离心30min，离心结束，将1.5mL的Tube放在装有冰的盒子里，小心吸取管中液体，移至1.5mL的Tube中，回收上清。根据800μLDDW,200μL考马斯亮蓝，1μL蛋白样品的比例配制定量体系，检测溶液中蛋白质浓度，并在495nm处用分光光度计进行检测，统计数值。据标准蛋白质曲线计算蛋白质浓度，将蛋白质样品定量为30μg，沸水浴5min，使上清液中的蛋白质变性，放入-20℃冰箱备用。将胶板与模具进行清洗后，放到架子上晾干。将胶板安装在模具上，加入DDW进行检验是否漏水。未发现漏水现象后，配制下层胶。用旋涡振荡器混匀后，加入到胶板内，再加入DDW进行压平。下层胶（分离胶）成形后，开始配制上层胶（浓缩胶），根据样本的数量，选择合适的梳子，在上层胶未成形以前插入。拔去梳子后，将胶板取下，清洗胶板表面的胶，安装到电泳槽中，并加入电泳液（ElectronBuffer）留以备用。蛋白质经12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，将胶从电泳槽中取出，按照阴极—海绵垫—滤纸—分离胶—NC膜（美国Millipore公司）—滤纸—海绵垫—阳极的顺序安装转膜夹，将转膜夹放入转膜桶，倒入转膜液。在4℃条件下通电，130mA过夜转膜。用0.1%丽春红染色并进行剪膜，用1×TBST含有15mmol·L-1的NaCl(Tris-HCL,TBS）、0.2%Tween-20、10mmol·L-1的Tris-HCl洗涤直到丽春红洗净为止，脱脂乳封闭1h，用1×TBST洗5次，每次5min，加入α-tubulin、ErK、p-ErK、cyclinD1、PCNA单克隆抗体于4℃冰箱中孵育过夜，回收一抗，用1×TBST洗涤5次，每次5min，脱脂乳封闭10min，使用1×TBST将一抗洗净，在摇床上快摇，每5min更换一次，共洗涤30min。按照一抗对应加入1μL二抗（山羊抗小鼠、山羊抗兔）室温孵育1h，用TBST洗涤5次，每次5min。配制ECL超敏发光液，避光保存。利用增强化学发光（E-CL）技术，用辣根过氧化酶偶联的二抗检测结合抗体，并对所得数据进行统计学分析。

1.3.7统计学分析

实验数据以“平均值±标准差”表示，组间差异采用t检验，P<0.05为有统计学差异，P<0.01为有显著统计学差异，P<0.001为有极其显著的统计学差异，所有数据ImageJ软件进行统计学分析。每组实验均重复3次。

2、结果

2.1真皮间充质干细胞分泌因子凝胶剂能促进老化皮肤创伤愈合

为研究真皮间充质干细胞（DMSCs）分泌因子对衰老小鼠创伤愈合的影响，采用DMSCs分泌因子凝胶剂处理衰老小鼠皮肤全层切除模型，观察衰老小鼠创伤愈合的情况。结果表明，分泌因子凝胶组在愈合过程中伤口面积明显小于空白对照组（图1A），经统计学分析，分泌因子组的伤口面积显著低于空白对照组（图1B),H&E染色结果表明，第9d时，各组均有肉芽组织填埋伤口，分泌因子凝胶组创面已被填埋，上皮完整，愈合基本完成；空白对照组上皮较薄，再生不完全（图1C）。表明真皮间充质干细胞分泌因子凝胶剂能够促进老化皮肤创伤愈合。

2.2真皮间充质干细胞条件培养基能促进真皮成纤维细胞增殖

为了探究DMSCs分泌因子促进老化皮肤创伤愈合的机制，采用含有DMSCs分泌因子的条件培养基处理真皮成纤维细胞，利用MTT法检测真皮成纤维细胞的细胞活力；利用蛋白质免疫印迹法检测增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1表达水平。结果表明，与空白对照组相比，DMSCs条件培养基组处理后的真皮成纤维细胞的细胞活力显著增加（图2A），增殖相关蛋白PCNA、CyclinD1表达水平显著上升（图2B）。表明DMSCs条件培养基能促进真皮成纤维细胞增殖。

图1DMSCs分泌因子凝胶剂对老化小鼠皮肤伤口愈合的影响

图2DMSCs-CM能促进真皮成纤维细胞的增殖

2.3真皮间充质干细胞分泌因子通过ErK1/2信号通路促进真皮成纤维细胞增殖

ErK1/2是MAPK信号通路的重要成员，通过磷酸化其底物，参与细胞增殖、应激、分化、凋亡和炎症的调控[6]。为了探究DMSCs分泌因子促进真皮成纤维细胞增殖的分子机制，在分子水平上检测真皮成纤维细胞内ErK1/2,p-ErK1/2蛋白表达水平。结果表明，与空白对照组相比DMSCs条件培养基组pErK1/2表达水平显著上升，ErK1/2表达水平基本不变（图3）。这说明，真皮间充质干细胞分泌因子可以通过调节真皮成纤维细胞内的ErK1/2信号通路促进真皮成纤维细胞增殖。

图3DMSCs分泌因子通过ErK1/2信号通路促进真皮成纤维细胞增殖

3、讨论

随着全世界老龄化人口数量的不断增加，老年群体创伤发生率越来越高，值得关注的是常规治疗创伤的方法对于老年创伤患者治疗效果并不明显。因此，探究有效治疗老化皮肤创伤的方法具有重要意义。研究表明，间充质干细胞对皮肤创伤具有良好的治疗效果，无论是内源性干细胞还是移植的外源性干细胞均能起到促进伤口愈合的作用。起初人们认为，间充质干细胞治疗伤口愈合主要是通过自身的增殖、分化来替代和补充受损伤的细胞，但最新的研究表明，移植的外源性间充质干细胞在伤口部位存活率较低，也极少会分化成其他的细胞，同时发现即使植入的间充质干细胞远离实际损伤部位，但仍可以促进伤口愈合[7,8]，因此研究人员认为间充质干细胞是可能通过旁分泌的方式发挥治疗效果。

在皮肤创伤愈合过程中，真皮成纤维细胞被认为是参与皮肤组织再生的主要细胞，它参与了皮肤创伤愈合一些关键的过程[9,10,11]。在炎症阶段结束增殖阶段开始时，真皮成纤维细胞会快速增殖，然后分泌多种基质金属蛋白酶来膨胀和降解纤维蛋白凝块，并将其替换为细胞外基质成分，如胶原蛋白IIV、XVIII、糖蛋白、蛋白聚糖、层粘连蛋白、血小板反应蛋白、糖胺聚糖（GAGs）、透明质酸（HA）和硫酸肝素[12]。这种复杂的基质支持并调控成纤维细胞的迁移和活性，同时也为血管生成、肉芽组织生成和上皮化提供支持和信号[13,14]，进而促进皮肤创伤愈合。研究表明脂肪间充质干细胞条件培养基（ASCs-CM）中bFGF、EGF均可显著促进真皮成纤维细胞的增殖[15]。骨髓间充质干细胞能分泌特殊的细胞因子如VEGF,igf-1,EGF等对伤口愈合很重要的细胞因子促进真皮成纤维细胞的增殖和迁移[16]。脐带间充质干细胞（MSCs）条件培养液能够促进皮肤组织损伤修复，且经ELISA测定，条件培养液中含有高浓度VEGF、IL-8、MCP-1生物活性因子[17]。这与实验的结果相一致，研究采用真皮间充质干细胞分泌因子凝胶剂治疗老化皮肤创伤，结果显示分泌因子凝胶组伤口愈合率显著高于空白对照组；采用MTT法检测真皮间充质干细胞分泌因对真皮成纤维细胞增殖能力的影响，结果显示分泌因子组真皮成纤维细胞的增殖速度明显高于空白对照组。这表明，真皮间充质干细胞分泌因子凝胶剂通过干细胞分泌的多种分泌因子促进成纤维细胞增殖加快老化皮肤创伤愈合。研究显示FGF和TGFβ-1诱导的成纤维细胞增殖，并均能够被ErK1/2特异性抑制剂所消除[18]，同时，实验的研究结果也表明干细胞条件培养基处理真皮成纤维细胞，细胞内的P-ErK1/2表达水平明显升高。综合以上的结果表明，真皮间充质干细胞分泌因子可能是通过激活成纤维细胞内ERK1/2信号通路，加快细胞增殖，促进老化皮肤伤口愈合。同时实验推测ErK1/2信号通路可能是多种细胞因子调控成纤维细胞增殖的共同下游信号通路，这将是下一步研究的重点。

由于含有间充质干细胞分泌因子的条件培养基为液体，不能长时间停留在伤口表面，严重抑制干细胞相关产品的治疗效果。因此，需要选用一种能够承载干细胞条件培养基的药物，使得培养基内的细胞因子更好的进入皮肤伤口部位，发挥治疗效果。实验采用卡波姆为凝胶基质，卡波姆是主要用于皮肤治疗剂的药物辅料，是国家药典中规定的药物辅料，是多种凝胶基质生物黏附材料、控缓释制剂的骨架材料等。以卡波姆为基质制作的凝胶剂易涂展、无油腻性，附着性和均匀性良好，对皮肤和黏膜无刺激性且使药物呈零级或近似零级释放[19,20,21]，能最大限度维持药物疗效。因此，研究通过制备真皮间充质干细胞分泌因子凝胶剂，探究干细胞分泌因子对老化皮肤创伤愈合的影响，阐明真皮间充质干细胞分泌因子通过ErK1/2信号通路促进真皮成纤维细胞增殖加速老化皮肤创伤愈合的作用，为治疗老化皮肤创伤提供新思路。

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基金:黑龙江八一农垦大学大学生创新创业训练计划项目(XC2019025).