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蛇草肾炎颗粒对C-BSA膜性肾病小鼠ERK1/2和cPLA2通路的影响

2023-07-08 45 上传者：管理员

摘要：观察蛇草肾炎颗粒对C-BSA膜性肾病小鼠ERK1/2(细胞外调节蛋白激酶)和cPLA2(细胞质磷脂酶A2)信号通路蛋白的影响，探讨蛇草肾炎颗粒对膜性肾病的作用机理。方法:将50只小鼠随机分为正常对照组、模型组、蛇草肾炎颗粒高剂量组(7.8 g/kg)、低剂量组(3.9 g/kg)及洛汀新组(1.26 g/kg)。采用小鼠尾静脉注射C-BSA复制膜性肾病模型，造模后各组按照小鼠体质量分别灌胃给药；正常组、模型组灌胃等量生理盐水，每天1次，灌胃28 d。观察各组小鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白的变化情况；末次给药后，采用Western blotting法检测肾组织ERK1/2、p-ERK1/2、cPLA2、p-cPLA2信号通路蛋白。结果:与正常对照组比较，模型对照组小鼠24 h尿蛋白定量显著升高(P<0.01);与模型对照组比较，洛汀新组、蛇草肾炎颗粒低、高剂量组小鼠24 h尿蛋白定量均显著降低(P<0.05或P<0.01)。与正常组比较，模型组小鼠血清白蛋白水平显著降低(P<0.05);与模型组比较，蛇草肾炎颗粒高、低剂量组血清白蛋白含量均显著升高(P<0.01)。与正常对照组比较，模型组小鼠肾组织ERK1/2和cPLA2磷酸化表达显著升高(P<0.01);与模型组比较，蛇草肾炎颗粒高、低剂量组肾组织ERK1/2和cPLA2磷酸化的水平均明显降低(P<0.05、P<0.01)。结论:蛇草肾炎颗粒能够显著降低膜性肾病小鼠尿蛋白，升高血清白蛋白水平，降低ERK1/2和cPLA2磷酸化蛋白表达是其作用机制之一。

关键词：
ERK1/2
尿微量白蛋白
膜性肾病
蛇草肾炎颗粒
血清白蛋白
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膜性肾病(membranous nephropathy, MN)是肾病综合征常见的病理类型之一，其主要表现为肾小球基底膜(glomerular basement membrane, GBM)的增厚和免疫复合物的沉积[1]。在我国原发性肾小球疾病中，MN约占9.89%～14.3%[2,3],并且呈不断上升的趋势。同时，膜性肾病具有易反复发作、慢性迁延的特点，其中约30%～40%的患者在发病5～15年内会发展为终末期肾脏疾病[4]。蛇草肾炎颗粒为本院院内制剂，在本院肾病科已应用十余年，临床观察显示蛇草肾炎颗粒可改善模型肾病患者的临床症状体征，总有效率为80%,其中显效率为53%[5]。本研究通过小鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白(C-BSA)复制实验性膜性肾病模型，观察蛇草肾炎颗粒对小鼠24 h尿蛋白定量、血清白蛋白等生化指标及ERK1/2和cPLA2信号通路蛋白的影响，探讨其作用机制。

1、材料

1.1动物

成年雄性ICR小鼠52只，体质量(30±3)g,购自哈尔滨医科大学实验动物中心，实验动物生产许可证：SCXK(黑)2019-001。于GLP实验室适应性喂养1周，温度20～26℃、相对湿度40%～70%。

1.2药物和试剂

蛇草肾炎颗粒(组成：黄芪、党参、芡实、丹参、地骨皮、黄芩、半枝莲、茯苓、地黄、僵蚕、车前子、山茱萸、益母草、白花蛇舌草):黑龙江省中医药科学院制剂室制备，黑药制字：Z20100002;洛汀新：北京诺华制药有限公司，批号：国药准字H20030514。C-BSA:北京博蕾德生物科技有限公司；完全弗完全佐剂：Sigma公司；24 h尿蛋白定量试剂盒、血清总蛋白、白蛋白试剂盒：南京建成生物工程研究所；BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶快速制备试剂盒、ERK1/2、p-ERK1/2、cPLA2:Wanleibio公司，p-cPLA2:Affinity公司。

1.3主要仪器

全自动生化分析仪：日本OLYMPUS公司；日立H-7650型电镜：日立科学仪器有限公司；H-2050R型超速冷冻离心机：湖南湘仪离心机有限公司；DYY-7C型电泳仪：北京六一仪器厂；ELX-800酶标仪：美国BIOTEK公司。

2、方法

2.1模型制备

42只小鼠给予0.2 mg C-BSA和等体积的弗氏完全佐剂乳化成的乳白色悬液多点皮下注射，进行预免疫；2周后，进行正式免疫：小鼠尾静脉注射C-BSA(13 mg/kg),隔日注射，每周3次[6]。正常对照组予生理盐水，操作同造模组。小鼠免疫6周后留取小鼠24 h尿液和血液，测24 h尿蛋白定量、白蛋白、总胆固醇、三酰甘油等确定动物模型初步成功。从42只造模小鼠中随机取2只处死，取肾组织，在光镜下可见GBM外侧上皮下嗜复红蛋白沉积，同时可见GBM钉突形成、链环样改变或GBM弥漫性增厚，提示造模成功[7]。

2.2实验分组与给药

40只成模后小鼠随机分为模型组、洛汀新组、蛇草肾炎颗粒低剂量组、蛇草肾炎颗粒高剂量组，每组10只；另取10只正常小鼠做正常对照组。洛汀新组予洛汀新1.26 mg/(kg·d)灌胃，中药低剂量组、高剂量组予蛇草肾炎颗粒3.9、7.8 g/(kg·d)灌胃，正常对照组、模型组等剂量生理盐水灌胃，连续给药28 d。

2.3观察指标及测定

2.3.1 24 h尿蛋白定量测定

末次给药后，用代谢笼留取小鼠24 h尿液，离心(3 500 r/min、15 min),取上清液，双缩脲法测定24 h尿蛋白定量(UPT)。

2.3.2血清总蛋白、血清白蛋白检测

末次给药后，禁食不禁水12h,小鼠摘眼球取血，生化仪检测血清总蛋白(TP)、血清白蛋白(ALB)。

2.3.3肾组织p-ERK1/2、ERK1/2、p-cPLA2、cPLA2蛋白表达检测

采用Western blotting法检测相关蛋白的表达水平。用戊巴比妥钠(10 mL/kg)麻醉后，处死小鼠，打开腹腔，摘取双肾并冲洗，除去血污及脂肪等，取一侧肾脏4%多聚甲醛溶液固定，根据每个样本的质量及体积加入相应体积的含有1%的苯甲基磺酰氟的裂解样本，置于冰上静置5 min,放入4℃离心机，离心(12 000 r/min, 10 min),分离上清液得蛋白质抽提物；采用BCA法测定抽提物中蛋白浓度，配制5%分离胶和8%、12%浓缩胶，并加入上样缓冲液，煮沸5 min,制成上样液备用。依次加样，在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶中电泳；电泳完毕后进行转印，将目的蛋白电转印至PVDF膜上，浸入含5%脱脂奶粉的聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯(TBST)缓冲液中封闭1 h;分别加入相应的一抗，置于4℃中孵育过夜，洗涤4次，每次5 min;室温下加入二抗，洗涤6次，每次5 min;取出PVDF膜，将ECL发光液均匀地洒在PVDF膜上，在暗室进行曝光，将胶片进行扫描，用凝胶图象处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带的光密度值。

2.4统计方法

实验数据采用统计软件SAS9.2进行统计，计量资料均以(x¯±s)表示，通过单因素方差分析进行比较，组间两两比较采用LSD-t检验。P<0.05认为有统计学意义。

3、实验结果

3.1蛇草肾炎颗粒对膜性肾病小鼠24

h尿蛋白定量和血清白蛋白、总蛋白的影响见表1。

表1各组小鼠24 h尿蛋白定量及血清白蛋白、总蛋白含量的比较(x¯±s)

3.2蛇草肾炎颗粒对膜性肾病小鼠ERK1/2、P-ERK1/2、cPLA2、p-cPLA2蛋白表达的影响

结果见图1,表2

图1各组小鼠肾组织cPLA2、p-cPLA2、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达的Western Blotting检测结果

4、讨论

膜性肾病的确切发病机制目前尚未明确，主要认为是足细胞膜上某些抗原与相应的抗体结合后形成免疫复合物，激活补体系统形成膜攻击复合物(C5b-9),导致足细胞损伤而产生蛋白尿。PLA2作为与磷脂代谢有关的一种酶，广泛参与机体细胞内外信号的传递及炎症反应或与多种炎症相关疾病的病理反应，其产生的磷脂酶A2受体(PLA2R)是目前研究比较多的一种足细胞靶抗原[8]。在膜性肾病发展过程中，前列腺素和血栓素起到多种病理生理作用，两者主要由花生四烯酸(AA)在环氧化酶和血栓素合成酶的作用下转化而来，而C5b-9通过激活胞质PLA2的主要亚型之一的cPLA2释放游离AA,从而引起蛋白尿[9]。此外，C5b-9还可以反式激活受体酪氨酸激酶以磷酸化ERK1/2的Ser/Thr双位点，从而使ERK信号通路被激活，激活的ERK信号通路可以促进细胞质靶蛋白的磷酸化或调节其他蛋白激酶的活性，其中cPLA2是ERK磷酸化的靶点之一。因此，cPLA2的激活也可以通过激活ERK信号通路来实现[10]。本研究结果显示，蛇草肾炎颗粒能够降低ERK1/2和cPLA2磷酸化蛋白表达，通过抑制ERK/cPLA2信号通路激活，可以减少膜磷脂水解，进一步保护肾小球和毛细血管完整结构，升高肾小球滤过率，从而延缓膜性肾病的进展[11]。

表2各组小鼠肾组织cPLA2、p-cPLA2、ERK1/2、P-ERK1/2蛋白表达的比较(x¯±s)

MN在临床上主要表现为大量蛋白尿，并在慢性肾脏病肾功能进展的过程中发挥着重要作用，因此临床治疗MN的关键是减少尿蛋白和升高血清蛋白。蛇草肾炎颗粒是本院名老中医王铁良教授在清心莲子饮的基础上加减化裁而成(组成：黄芪、党参、黄芩、益母草、丹参、山茱萸、茯苓、车前子、僵蚕、地骨皮、半枝莲、白花蛇舌草、芡实、地黄等),除清心泻火、益气养阴、止淋化浊功用外，又加入了丹参、益母草化瘀兼利水湿；山萸肉补肾涩精；加入半边莲、白花蛇舌草等增强清利湿热作用。而蛇草肾炎颗粒中主要药物黄芪在调节机体免疫方面，具有增强和抑制的双向调节作用，在有效减少蛋白尿的同时，不仅可以升高血清蛋白、纠正脂质代谢紊乱，还可以有效地改善机体的高凝状态，保护肾脏正常生理功能[12]。

本研究结果显示：蛇草肾炎颗粒能降低C-BSA膜性肾病小鼠的尿蛋白，升高血清ALB水平和总蛋白含量，减少ERK1/2和cPLA2磷酸化蛋白表达，保护肾脏，延缓MN的进展。

参考文献:

[1]东瑞娟.lgA肾病和膜性肾病患者肠道菌群研究[D].西安:空军军医大学,2019

[4]李莉.多靶点治疗难治性特发性膜性肾病的前瞻性研究[D].郑州:郑州大学,2017.

[5]李向新.蛇草肾炎颗粒治疗慢性肾小球肾炎气阴两虚型临床研究[D]哈尔滨:黑龙江省中医研究院,2012.

[7]彭素英,王玉洁,何宇,等.阳离子化牛血清白蛋白膜性肾病大鼠模型的建立与鉴定[J].山东医药,2016,56(48):36-38.

[8]丁秀,袁军,邹新蓉,等.基于ERKICPLA2信号通路探讨膜肾方对膜性肾病大鼠模型的干预作用及其机制[J].时珍国医国药,2021,32(10):2334-2336.

[11]叶文冲,王瑞忠,曾桐春,等.组分配伍四逆汤抑制ERKCPLA2信号通路改善大鼠膜性肾病[J.药物评价研究,2018,41(6):1021-1025.

[12]蔡小凡,邓跃毅,钟逸斐,等.参芪膜肾颗粒对膜性肾病大鼠的治疗作用及机制初探[J].中国中西医结台肾病杂志,2017,18(10):852-855.

基金资助:黑龙江省卫生健康委课题(2020-282);

文章来源:谢家辉,赵铭宇,许诺等.蛇草肾炎颗粒对C-BSA膜性肾病小鼠ERK1/2和cPLA2通路的影响[J].中国中医药科技,2023,30(04):639-642.