头颈部肿瘤是一类常见肿瘤，研究报道发现全世界和中国每年头颈部肿瘤新增病例占所有肿瘤的7.1%和7.7%,治疗方式以放疗和化疗为主[1]。最新研究指出分割放疗时减轻X射线致大鼠口腔黏膜病变程度，与放疗联合化疗的方法改善了头颈癌患者的局部肿瘤的控制、提高了器官保存率和生存率[2,3,4]。然而，这种治疗是以增加相关显著毒性为代价的，放疗所致吞咽困难进而导致的营养不良率超过66%[5]。在采取放射性治疗的过程中，不仅杀伤了肿瘤细胞，同时不可避免使放疗区域的黏膜上皮细胞的损伤诱导了促炎因子的产生，当影响到基底细胞时，已经产生的炎性因子的正反馈机制启动促进了更强烈的炎症反应，最终产生严重的溃疡[6]。放射性损伤受细胞免疫，体液免疫和细胞因子共同影响[7]。细胞因子的作用方面，在肿瘤环境与炎性症状共同作用下，抗肿瘤及促进炎症反应的TNF-α在口腔溃疡患者中的表达水平表现出明显的提高，并且呈现紧密的正相关[8]。多类型的白细胞介素在口腔溃疡患者的体内也会进行高水平表达，如IL-1也会随着疾病产生与治疗进行高表达与相应的降低，同时还有具有中性粒细胞的聚集功能，放大炎症反应[9]。IL-6的降低被证实是促进口腔溃疡恢复的有效手段，其表达会促进细胞免疫与体液免疫的活化，与病程的进展呈正向关系[7,10]。

口腔溃疡作为头颈癌放疗患者常见且严重的副作用，其临床表现为剧烈疼痛以及进食和吞咽困难，病情严重的患者需要食管进食，甚至过早地停止放射性治疗，这种副作用减缓了患者的恢复速度，增加了医疗费用负担，对生活质量有重大影响[11,12]。目前临床上还没有被批准的治疗放射性口腔黏膜炎的药物。相关的治疗经验总结了通过口腔含漱，局部涂抹或贴敷，口服药剂或静脉注射的干预手段及杀菌，镇痛、抗炎，提高机体抵抗力的治疗思路[13]。中医理论认为放射线为热毒，放射性口腔黏膜炎是以热毒炽盛，津液内耗，阴虚火旺，气阴两虚，造成血淤热结的基本病机[14]。临床研究中，复方苦参注射液单用或联用也被证明可以降低炎性细胞水平，减轻机体炎症反应[15,16]。复方苦参注射液主要由苦参、白土苓组成，具有清热利湿，凉血解毒，散结止痛的作用，从机制上符合治疗放射性口腔黏膜炎的特点[17]。本研究以大鼠单次口腔颊部照射形成的口腔黏膜炎为模型，探讨并验证清热解毒药物复方苦参注射液对放射性口腔黏膜炎的治疗作用，并提取分析了相关炎性因子，见图1。为后续的复方苦参注射液口服改剂提供数据支持。

1、材料与方法

1.1动物

SPF级SD大鼠90只，体重178.6～388.3 g,购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2019-0004。

图1模型构建、给药与模型数据收集   

1.2药物及试剂

复方苦参注射液，批号：20191116(山西振东制药股份 有限公司)。重组人表皮生长因子外用溶 液(金因肽),规格：2 000 IU/mL,15 mL/支，批号：20210407(深圳市华生元基因工程发展有限公司)。0.9%氯化钠注射液，100 mL/瓶，批号：21012901D(湖南康源制药有限公司)。白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)酶联免疫分析试剂盒，批号均为202107,以上试剂盒均由江苏酶免实业有限公司提供。

1.3器材

X-RAD225型生物学X射线辐照仪[汇佳生物科技(上海)有限公司]、台式高速冷冻离心机(湖南湘立，本中心编号：675)、Spectra Max i3x型多功能酶标仪(奥地利美谷光子公司，本中心编号：525)、DFC 420C型病理成像系统(德国Leica);DM2500型荧光显微镜(德国Leica);TP1020型全自动脱水机(德国Leica);EG1150H+C型组织包埋机(德国Leica);RM2235型石蜡切片机(德国Leica)、CX31型生物显微镜(日本奥林巴斯公司);CV5030+HV型全自动封染一体机(德国Leica);BX43+MD50型生物显微镜+数码成像系统(日本奥林巴斯公司)。

1.4方法

1.4.1放射性口腔溃疡动物模型构建

各组大鼠按5 mL/kg腹腔注射20%乌来糖麻醉后，按15 Gy剂量采用X射线照射(源皮距FSD=40.0 cm,剂量率为2.5 Gy/min)大鼠口部及内侧口腔黏膜，6 min/只，其余部位采用5 mm的铅皮遮住，另取10只正常对照组不做处理，照射后每只动物灌胃给予4 mL/只0.9%氯化钠注射液。

1.4.2用药及分组

选取检疫合格SPF级SD大鼠90只，雌雄各半，体重178.6～388.3 g,按体重与性别分为9组，每组10只/组(5雄+5雌),分别为正常对照组、模型对照组、金因肽组、复方苦参注射液喷雾组、复方苦参注射液静脉组(1.8 mL/kg)、复方苦参注射液剂量1、2、3、4组(0.45、0.9、1.8、3.6 mL/kg)。使用s统计大鼠按体重的分组情况，由于雌性，雄性大鼠体型差异较大，分组进行计算，见表1。

表1动物分组(g,x¯±s)

各组动物分别于造模后24 h给予不同浓度的药物，正常对照组和模型对照组经口灌胃给予等体积的0.9%氯化钠注射液，金因肽组和复方苦参注射液喷雾组动物每次一喷，每天1次，连续14天。使用复方苦参注射液原液根据不同浓度实验组以1 mL/100 g为给药容量(静脉注射/口服)进行样品配制。复方苦参注射液静脉组动物经尾静脉注射1.8 mL/kg的复方 苦参注射液溶液，复方苦参注 射液口服1、2、3、4组动物经口灌胃分别给予浓度为0.45、0.9、1.8、3.6 mL/kg的溶液，见表2。

表2对照组与复方苦参注射液各组给药剂量

1.4.3观察指标

一般临床观察：每天观察动物口腔黏膜的变化和动物一般行为活动，于d4、d7、d10、d14对各组动物称重，于d7、d14记录各组动物摄食量情况。

放射性口腔黏膜炎评分：于d4、d7、d10、d14对各组动物口腔黏膜进行评分。评分标准：0级，肉眼观察溃疡恢复至正常状态，计“0”分；1级，表面无明显假膜，计“1”分；2级，溃疡表面有薄层黄白色假膜，周围无水肿，计“2”分；3级，溃疡表面假膜较厚，且周围伴有炎性水肿，计“3”分。

细胞因子检测：末次给药后次日各组大鼠按异氟烷(1%～4%诱导麻醉，0.25%～2%维持麻醉)吸入麻醉后安乐死，取左侧口腔黏膜组织，按组织质量(g)∶0.9%氯化钠注射液(mL)=1∶9加入0.9%氯化钠注射液，采用高速匀浆机进行匀浆，制成口腔黏膜匀浆液，4℃环境中3 000 r/min离心15 min,取上清，ELISA试剂盒检测上清液中IL-6、TNF-α、IL-1β的含量。

病理学检验：取右侧口腔黏膜组织置于10%中性福尔马林溶液固定24 h, HE染色，镜下观察口腔黏膜组 织病理学变化。

1.5统计学方法

采用SPSS 22.0进行统计分析，统计学 意义的水平设定为P≤0.05。计量资料采用均数±标准差(x¯±s)。用Leven's test方法检验正态性和方差齐性。如果符合正态性和方差齐性，用单因素方差分析(One-way ANOVA)和post Hoc LSD进行统计分析；如果不符合正态性和方差不齐，则用Kruskal-Wallis检验。如果Kruskal-Wallis检验有统计学意义(P≤0.05),则用Dunnett's Test(非参数方法)进行比较分析。计数等级资料采 用频数表示，进行等级资料的秩和检验。

2、结果

2.1一般临床观察结果

试验期间，造模后d1模型动物口腔可见红肿，d3出现摄食减少，自主活动减少，口腔黏膜红肿，并伴有流涎，造模后d4～d10动物口腔黏膜泛白，形成一定的假膜，并伴有流涎。金因肽和复方苦参注射液静脉给药组动物连续给药4天，肉眼观察口腔黏膜炎症状有明显的改善，复方苦参注射液剂量3(1.8 mL/kg)、4组(3.6 mL/kg)连续给药1周，动物自主活动、摄食量较之前有明显增加，且流涎也有相应的改善，随着给药时间的延长，各组动物口腔黏膜炎症状均有不同程度的改善，其中复方苦参注射液剂量3.6 mL/kg对放射性的口腔黏膜炎症状改善更明显。

2.2对模型生存状态的影响

2.2.1体重变化

在X射线造模后的第4天、第7天、第10天和第14天进行体重测量，计算体重增长率，生成体重增长率变化图(图2)。结果显示，与正常对照组比较，模型对照组动物体重增长较缓慢；与模型对照组比较，模型给药组生长组增长率稳步增加，但总体水平较低；实验给药组增长率提升较快，其中CKI口服剂量组4口服剂量3.6 mL/kg体重增长率最高，见图2。

2.2.2进食量变化

与正常对照组比较，造模后各组动物摄食量均明显降低，随着给药时间的延长，各组动物摄食量稍有增加。

2.3对放射性口腔黏膜炎评分的影响

于放射性治疗后给药前与第4、7、10、14天进行口腔黏膜炎性评分。正常对照组炎性评分保持为0,模型对照组炎性评分保持为最高，CKI喷雾组于10 d有明显的下降，口服CKI剂量组均有明显的抑制口腔黏膜炎性的作用(图3)。与正常对照组比较，模型对照组动物口腔黏膜评分均明显增加(P≤0.01);与模型对照组比较，金因肽组于给药d4、d7评分明显降低(P≤0.01),复方苦参注射液喷雾组、复方苦参注射液口服剂量1、2组动物于d14评分均明显降低(P≤0.01),复方苦参注射液静脉组于给药d4、d7、d14评分均明显降低(P≤0.05),复方苦参注射液口服剂量3、4组于给药d7、d10、d14评分均明显降低(P≤0.01),见表3。

表3复方苦参注射液对放射性口腔黏膜炎模型大鼠评分的影响(分,x¯±s)

图2各组大鼠体重增长率   下载原图

Fig.2 Body weight growth rate of each group

2.4对口腔黏膜细胞因子的影响

与正常对照组比较，模型对照组TNF-α、IL-6水平均明显升高(P≤0.01),IL-1β也有升高趋势，并无明显统计学差异；其中TNF-α、IL-6的检测中，与模型对照组比较，金因肽组、复方苦参注射液口服剂量3、4组因子含量均明显降低。IL-1β组中金因肽组、复方苦参注射液口服剂量4组水平均明显降低(P≤0.05),见图4。

图3各组大鼠口腔黏膜评分变化   

图4复方苦参注射液对放射性口腔黏膜炎模型大鼠细胞因子的影响  

2.5对口腔黏膜组织的影响

取右侧口腔黏膜组织进行HE染色，正常对照组动物镜下观察可见口腔黏膜上皮细胞完整，未见出血和溃疡病灶，且未见炎症细胞浸润；模型对照组动物镜下观察明显可见口腔黏膜上皮坏死脱落，局部溃疡灶，伴有出血，同时固有层少量炎症细胞浸润；造模后给予相应剂量的金因肽、复方苦参注射液，口腔黏膜病变较模型对照组均具有不同程度的减轻，动物镜下观察可见金因肽组与CKI静脉组、喷雾组、口服剂量组1图中可见细胞层增厚并趋于完整；CKI口服剂量组2、3、4组形成了完整的上皮细胞层，溃疡区域相对愈合良好，见图5。

图5口腔黏膜病理切片(HE×400)   

A:正常对照组；B:模型对照组；C:金因肽组；D:CKI静脉组；E:喷雾组；F:口服剂量组；G、H、I:CKI口服剂量组2、3、4组。

3、讨论

放射性口腔黏膜炎是一个复杂的生物学过程，涉及一系列动态的、相互作用的泛黏膜事件。目前认为放射性口腔黏膜炎是炎性因子、氧化自由基及致病微生物三者相互作用的结果。研究发现放射诱导的炎性因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 在这一复杂的病理演变过程中起着关键作用[18,19]。TNF-α 是一种常见的促炎症因子，主要由活化的T细胞产生，为黏膜受损时机体最早作出应答的介质之一，其能通过与另一种促炎因子IL-1β 协同触发炎症级联反应，诱导IL-6等多种炎症因子的产生[20,21]。IL-6是一种具有广泛活性的细胞因子，在免疫应答和炎症性疾病病理中具有重要的作用。在大鼠放射性口腔黏膜炎模型中，黏膜组织IL-6的水平与口腔黏膜炎的严重程度呈正相关[19]。体重、口腔黏膜评分和组织病理是评估放射性口腔黏膜炎的重要指标。本次试验通过X射线口腔照射大鼠，在不同时间点进行评分和病理检查，观察口腔黏膜病变程度与时间的关系。

放射性口腔黏膜炎属于中医“喉痹”的范畴。中医学认为放射线为火热毒邪，机体接受放疗后感受热毒，易灼伤津液，使口腔黏膜失去濡养，直接灼伤口腔黏膜，从而导致口腔黏膜炎的发生。临床多表现为口咽疼痛、口干、舌红少津、脉数为特征的热毒炽盛证，治疗多采用清热解毒的原则[22,23]。复方苦参注射液由苦参、白土苓提取精制而成，其主要成分为苦参碱、槐果碱、氧化苦参碱等，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛作用。根据该处方的特点，在中医理论上应符合放射性口腔黏膜炎的病理生理过程。因此为验证复方苦参注射液对放射性口腔黏膜炎的治疗效果，本试验采用X射线照射(源皮距FSD=40.0 cm,剂量率为2.5 Gy/min)大鼠口部及内侧口腔黏膜，建立大鼠放射性口腔黏膜炎模型，造模后24 h经口灌胃给予不同剂量的复方苦参注射液，另选喷雾和静脉两种给药方式作为对照，并选用重组人表皮生长因子外用溶液作为本试验的阳性对照药，连续给药14天，通过观察动物一般生理指标(体重、摄食量)及口腔黏膜评分，并检测口腔黏膜组织匀浆液细胞因子，同时对口腔黏膜组织进行病理学检查，评价并比较不同给药方式复方苦参注射液治疗大鼠放射性口腔黏膜炎的作用。

本研究结果表明，辐照后的模型动物体重增长缓慢，摄食量减少，口腔黏膜评分增加，黏膜组织中IL-6、IL-1β 和TNF-α水平均有明显提高，且镜下观察可见口腔黏膜上皮坏死脱落，局部溃疡灶，伴有出血，同时固有层炎症细胞浸润，与临床疾病症状基本一致。经口灌胃给予不同浓度的复方苦参注射液后，复方苦参注射液口服剂量3、4(1.8、3.6 mL/kg,相当于临床拟用剂量的1倍、2倍)能明显增加动物体重增长率和摄食量，降低口腔黏膜症状评分，并能降低组织中TNF-α,IL-6水平，复方苦参注射液口服剂量1、2、3、4均能减轻X射线致大鼠口腔黏膜病变程度。金因肽和复方苦参注射液静脉给药均能明显增加动物体重和摄食量，在d4、d7能明显降低口腔黏膜评分，金因肽能明显降低口腔黏膜组织中IL-6和IL-1β的水平，复方苦参注射液静脉给药可降低IL-6的水平，均能减轻口腔黏膜病变程度。

综上所述，以15 Gy剂量采用X射线照射大鼠口部及口腔黏膜，可建立周期约为14天的口腔黏膜炎模型；复方苦参注射液口服给药对X射线致大鼠口腔黏膜炎具有明显保护作用，其作用机制可能与降低炎性因子水平有关。在同等剂量下，复方苦参注射液口服剂量3(1.8 mL/kg)治疗大鼠口腔黏膜炎的效果优于复方苦参注射液静脉给药。

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文章来源:王伟,周衍,王晓辉等.复方苦参注射液对大鼠放射性口腔溃疡模型的影响[J].现代肿瘤医学,2023,31(15):2803-2808.