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基于对Klotho表达的调控作用探讨何首乌提取物二苯乙烯苷对慢性肾衰竭大鼠高脂血症的影响

2023-07-08 63 上传者：管理员

摘要：探讨何首乌提取物二苯乙烯苷(TSG)对慢性肾衰竭大鼠肾脏Klotho蛋白表达及血脂变化的影响。方法:40只大鼠随机分为假手术组、模型组、TSG组[20 mg/(kg·d)]、缬沙坦组[55 mg/(kg·d)],每组10只。采用5/6肾脏切除法建立慢性肾衰竭模型，分别灌胃给药4周，假手术组与模型组给予等剂量饮用水灌胃。全自动生化分析仪检测大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),及24 h尿蛋白定量(24 hUP),计算三酰甘油与高密度脂蛋白胆固醇比值(TG/HDL-C)。肾组织HE染色，光镜观察肾脏病理改变；免疫组化及Western blot检测肾组织Klotho蛋白及TGF-β1(转化生长因子-β1)表达。结果:与假手术组相比，模型组SCr、BUN及24 hUP水平均升高(均P<0.01);与模型组比较，TSG和缬沙坦组以上指标均下降(P<0.05或P<0.01),两给药组之间无明显差异(P>0.05)。模型组TC、TG、LDL-C、TG/HDL-C均明显高于假手术组(P<0.05或P<0.01),TSG组以上指标明显降低，与模型组相比有明显差异(P<0.05或P<0.01),缬沙坦无降低血脂作用。免疫组化和Western blot结果显示，模型组Klotho蛋白表达明显低于假手术组(P<0.01),TGF-β1表达明显高于假手术组(P<0.01);TSG及缬沙坦均可以升高Klotho蛋白表达(P<0.05或P<0.01),降低TGF-β1表达(P<0.05或P<0.01)。结论:TSG能调节慢性肾衰竭大鼠血脂异常，尤其是降低TG水平及TG/HDL-C,保护肾功能，其作用机制可能与升高Klotho蛋白表达相关。

关键词：
Klotho
二苯乙烯苷
何首乌提取物
慢性肾衰竭
高脂血症
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慢性肾脏病是导致继发性高脂血症的主要原因之一，随着肾功能的恶化，血脂异常发生率逐渐升高[1,2]。血脂异常可加重肾病进展[3],同时，血脂异常是心血管疾病的高危因素，而心血管疾病是导致慢性肾脏病(CKD)和终末期肾病(ESRD)患者死亡的首位原因[4]。因此，纠正血脂异常与延缓肾病进展、降低慢性肾衰竭患者心血管疾病发生、改善预后密切相关。

Klotho基因作为经典的抗衰老基因，其编码的Klotho蛋白是对肾脏具有保护作用的因子，有抑制肾间质纤维化的作用[5]。近年的研究发现，Klotho与脂代谢异常存在相关性[6],通过干预调控Klotho基因的表达可能会成为血脂异常的一种新的治疗手段。

二苯乙烯苷(2,3,5,4,-tetrahydroxystilbene-2-O-β-D-glycoside, TSG)是何首乌中主要的水溶性生物活性成分，具有增加Klotho蛋白表达而抗衰老和肾脏保护作用[7,8]。另外研究发现，TSG有降低糖尿病小鼠血脂的作用[9],而TSG是否具有调控Klotho蛋白表达而改善慢性肾衰竭相关血脂异常方面尚无相关研究。本研究以慢性肾衰竭大鼠为研究对象，通过分析TSG对大鼠肾脏Klotho蛋白表达及血脂变化的影响，初步探讨TSG对慢性肾衰竭大鼠血脂的影响及可能的机制。

1、材料

1.1实验动物

选取8周龄清洁级雄性SD大鼠40只，体质量150～200 g,由浙江省医学科学院提供，动物许可证号SYXK(浙)2019-0011。饲养于温度19～23℃,湿度40%～60%环境中，并给与充足的水及饲料。

1.2实验药物及试剂

二苯乙烯苷(TSG):由杭州达文生物技术有限公司提供，批号：RFS-E02202103016。Klotho蛋白抗体：美国Thermo公司，批号：33585A02;重组Anti-TGF-β1抗体：英国Abcam,批号：00050616。

1.3主要实验仪器

AU5800全自动生化分析仪：Beckman; LX-165T2R冷冻离心机器：Haier Biomedica; KZ-Ⅱ组织匀浆机：Servicebio; Mini-PROTEAN4 Bio-RAD电泳仪：美国Bio-RAD;chemiscope 6100 Touch化学发光成像系统：上海勤翔。

2、方法

2.1造模方法

采用5/6肾脏切除法建立慢性肾衰竭模型[10]:腹腔注射麻醉后，将大鼠俯卧位固定于手术台上，术区备皮(肾区),碘伏常规消毒，左侧背部处做一斜向外约3 cm切口，暴露左肾并分离包膜，夹闭上下极使其缺血坏死，迅速切除左肾上下极约2/3组织，明胶海绵压迫止血，将组织回纳腹腔，向腹腔内注射青霉素预防抗感染，逐层缝合，关腹封口。1周后行右肾切除术，方法同上，分离右肾后，结扎右肾血管使其缺血坏死，摘除整个右肾。假手术组仅做肾脏被膜剥离术。

2.2动物分组及给药

将40只大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、TSG组与缬沙坦组，每组各10只。造模术后1周开始，所有动物每日1次灌胃给药，TSG组给予TSG 20 mg/(kg·d)灌胃，缬沙坦组给予缬沙坦55 mg/(kg·d)灌胃，假手术组与模型组给予等剂量饮用水灌胃，连续灌胃4周。

2.3观察指标及测定

2.3.1

一般情况

2.3.2肾功能、血脂水平检测

末次给药后，将大鼠置入代谢笼，收集24 h尿液，检测24 h尿蛋白定量(24 hUP)。第2日摘眼球取血，3 000 r/min离心15 min,取上层血清，检测大鼠血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C),计算三酰甘油与高密度脂蛋白胆固醇比值(TG/HDL-C)。以上指标均采用全自动生化分析仪检测。

2.3.3病理组织学观察

10%水合氯醛腹腔注射处死大鼠，取肾组织常规方法固定、包埋、切片，HE染色，光镜观察肾脏病理改变。

2.3.4免疫组化检测肾组织Klotho、TGF-β1蛋白表达

肾组织石蜡切片脱蜡，分别加入Klotho、TGF-β1抗体及二抗，DAB显色。光镜下观察棕黄色颗粒为阳性信号。采用Image J图像分析软件分析阳性面积占总视野面积百分比，计算5个视野均值，进行免疫组化半定量分析。

2.3.5 Western Blot检测肾组织Klotho及TGF-β1蛋白表达情况

取20 mg肾组织，加RIPA联合蛋白酶抑制剂，提取蛋白，进行SDS-PAGE电泳，蛋白样品电泳后转至PVDF,牛奶封闭后依次按时加入Klotho(稀释倍数1∶1 000)、TGF-β1(稀释倍数1∶1 000)和内参β-Tubulin(稀释倍数1∶3 000)一抗及二抗(稀释倍数1∶5 000),在ECL溶液中孵育2 min,显影仪中曝光30～60 s, Image J软件进行结果分析。

2.4统计学方法

采用SPSS22.0软件进行数据处理和分析。所有数据用(x¯±s)表示，多组间比较采用单因数方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1各组大鼠一般情况

实验过程中假手术组全部存活，模型组死亡2只，TSG组和缬沙坦组各死亡1只。造模后假手术组大鼠一般情况良好，无明显异常症状，其余3组则出现不同程度的烦躁不安、脱毛、尿量增多、体质量增加缓慢。

3.2各组大鼠24hUP和血清SCr、BUN检测结果

见表1。

表1各组大鼠24 hUP、SCr、BUN检测结果比较(x¯±s)

3.3各组大鼠血脂水平比较

见表2。

3.4各组大鼠病理组织学观察结果

假手术组未见明显肾脏病理变化，肾小球及小管结构轮廓无明显异常，间质未见明显炎细胞浸润。模型组可见明显的肾小球系膜细胞增生和基质增多，同时可见肾小管上皮肿胀、刷状缘脱落，伴有间质炎症细胞浸润。TSG组及缬沙坦组仍可见系膜细胞增生及基质增多，但肾小管上皮细胞肿胀及刷状缘脱落明显减轻，间质炎细胞浸润有所减轻。见图1。

表2各组大鼠血脂水平比较(x¯±s)

图1各组大鼠肾组织病理观察(×200)

3.5各组大鼠肾组织Klotho、TGF-β1蛋白表达的免疫组化检测结果

模型组Klotho蛋白表达明显降低(与假手术组相比P<0.01),TGF-β1明显升高(与假手术组相比P<0.01); TSG组与缬沙坦组均能升高Klotho蛋白表达(与模型组相比分别为P<0.01,P<0.05)、抑制TGF-β1表达(与模型组相比分别为P<0.05,P<0.01)。两治疗组之间在升高Klotho蛋白表达及抑制TGF-β1表达方面均无统计学差异(均为P>0.05)。见图2、表3。

图2各组大鼠肾组织Klotho及TGF-β1蛋白表达的免疫组化检测结果(×400)

表3各组大鼠肾组织Klotho及TGF-β1蛋白表达免疫组化检测结果比较(x¯±s)

3.6各组大鼠肾组织Klotho、TGF-β1蛋白表达的Western blot检测结果

模型组Klotho蛋白表达明显低于假手术组(P<0.01),而TGF-β1表达明显高于假手术组(P<0.01)。TSG与缬沙坦均能增加Klotho蛋白表达(均P<0.01),降低TGF-β1表达(均为P<0.01),两组之间无明显差异(均为P>0.05)。见图3

图3各组大鼠肾组织Klotho及TGF-β1蛋白表达的Western blot检测结果及比较

4、讨论

血脂异常与慢性肾脏病之间的关系密切。研究发现，随着肾功能的恶化，血脂异常发生率从的45.5%(CKD1期)升至67.8%(CKD4期)[1,2],而血脂异常反过来又可加重慢性肾病进展[3],并与慢性肾病患者心血管疾病预后密切相关。

在普通人群中，低密度脂蛋白胆固醇与动脉粥样硬化及心血管风险显著相关，然而，研究发现三酰甘油同样可以引起动脉粥样硬化，其机制与富含三酰甘油的多种脂蛋白如极低密度脂蛋白、乳糜微粒及其残留物相关。这些脂蛋白能够进入动脉并将其胆固醇成分沉积在血管壁促进动脉粥样硬化，降低三酰甘油与及较低的心血管风险正相关[11,12]。慢性肾病患者血脂异常以三酰甘油升高为突出表现，其低密度脂蛋白胆固醇可能出现升高也可能下降[13]。血三酰甘油与CKD的进展密切相关，其可能机制包括：高三酰甘油可通过炎症应激、氧化应激、内质网应激、内皮功能障碍以及肾素-血管紧张素系统的激活等机制加速CKD的进展；CKD患者血液中TG和脂质代谢分解产物的积累对肾脏和肾实质以外的血管系统具有致动脉粥样硬化和促炎作用，从而加重肾脏疾病[14,15,16]。因此，降低慢性肾衰竭患者血脂，尤其是三酰甘油，对于延缓CKD进展、改善肾病患者心血管预后尤为重要。

何首乌是传统抗衰老中药，具有调节脂质代谢的作用[17],作为降脂类方剂的核心药物，有降低血液中三酰甘油及胆固醇作用[18]。TSG是何首乌中主要的生物活性成分，研究发现，TSG能降低糖尿病小鼠的三酰甘油及总胆固醇水平[9]。对于TSG降脂机制，有部分学者研究发现，TSG可抑制内源性三酰甘油的合成，改善脂质在体内分布以及在内脏器官的沉积，提高肝细胞内脂蛋白脂肪酶、肝脂酶的活性，加速三酰甘油的分解，从而减少肝细胞内三酰甘油的堆积[19]。另有研究证实，TSG竞争性抑制合成胆固醇的限速酶，从而减少肝脏胆固醇的合成；同时，刺激肝细胞表面低密度脂蛋白胆固醇受体活性增加，促进血浆LDL-C的清除[20]。然而，关于TSG对慢性肾衰竭大鼠血脂异常的影响尚未见到相关报道。本研究证实，TSG有明显减少蛋白尿、保护肾功能的作用，同时有明确的降低慢性肾衰竭大鼠血脂的作用。

Klotho是经典的抗衰老基因。有学者发现，Klotho与血脂异常之间关系密切，通过对健康体检的老年人研究发现，Klotho蛋白浓度与年龄、总胆固醇、LDL-C呈负相关，与HDL-C呈正相关.血脂异常组血清Klotho蛋白明显低于血脂正常组[6]。动物实验也证实，Klotho能促进脂肪细胞的分化，减少脂质沉积，经Klotho喂养5周的肥胖大鼠，其肝脏脂肪沉积、白色脂肪组织及血三酰甘油明显低于对照组，进一步分析发现，Klotho能调节与肝脏和白色脂肪组织中脂质代谢有关的关键基因表达[21]。因此，通过调控Klotho的表达可以改善血脂异常。

近年来，较多研究证实，TSG能明显增加Klotho表达[7,8,15]。既往的研究更多关注在Klotho的肾保护作用，一致认为，Klotho基因在肾小管高表达，具有明确的抗氧化、抗炎、抑制肾间质纤维化相关因子如TGF-β1表达、保护肾功能的作用[22]。本研究中，TSG增加Klotho蛋白的表达、抑制TGF-β1表达、保护肾功能与既往研究一致。同时发现，TSG对慢性肾衰竭大鼠的血脂异常有明确的改善，因此推测TSG调控Klotho蛋白的表达在其中起到核心作用，即TSG通过升高Klotho蛋白的表达一方面可以保护肾功能，另一方面可以改善慢性肾衰竭大鼠血脂异常，基于调节Klotho蛋白表达从而改善血脂异常是TSG降低血脂的重要机制之一。

然而本研究仍有不足，尚未对TSG血脂相关基因如过氧化物酶酰基辅酶A氧化酶1(ACOX1)、过氧化物酶体增殖物激活受α(PPARα)等表达方面进行探索，今后可以开展相关研究，全面阐明药物可能的作用机制。

参考文献:

[6]王健,王蕾,卢惠茹.老年血脂异常与KIlotho蛋白的相关性研究[J].中华老年心脑血管病杂志,2015,17(10):1052-1054.

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[8]梅劲春,梁碧弹,侯伟俊,等.二苯乙烯苷通过上调肾小管上皮细胞Klotho表达治疗糖尿病肾病的研究[J.中国中西医结合肾病杂志,2015,16(10):866-869.

[9]陈雪,张嫄怡,李品玉,等.二苯乙烯苷对血糖波动性糖尿病小鼠血糖､血脂及肾脏功能的影响[J].广西医学,2021,43(19):2327-2330.

[10]陶琦,姚源璋.慢性肾功能衰竭动物模型研究进展[J].中国医药导报,2013,10(16);31-33.

基金资助:浙江省医药卫生科技计划项目(2017KY549);

文章来源:陈倩,毛俐婵.基于对Klotho表达的调控作用探讨何首乌提取物二苯乙烯苷对慢性肾衰竭大鼠高脂血症的影响[J].中国中医药科技,2023,30(04):656-661.