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不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群恢复的影响

2023-07-25 96 上传者：管理员

摘要：比较粪菌移植不同频率及时间对抗生素预处理小鼠肠道菌群恢复的影响。方法 24只C57BL/6J小鼠按体重随机分为对照组、粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3。对照组小鼠作为粪菌移植的粪便供体不做处理，粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3均经2周混合抗生素(200μL/d)干预，随后进行粪菌移植(200μL/d)。粪菌移植组1移植频率为1次/天，持续1周；粪菌移植组2移植频率为1次/天，持续2周；粪菌移植组3移植频率为3次/周，持续2周。实验结束后收集小鼠粪便，使用二代测序技术分析肠道菌群Alpha多样性、Beta多样性和物种组成。结果与对照组相比，粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3小鼠肠道菌群中存在较多独立的扩增子序列变体(amplicon sequence variants, ASV)且ACE指数和Chao1指数显著降低(P<0.05)。粪菌移植组Beta多样性与对照组间存在差异，粪菌移植组2与对照组最接近。门水平上，粪菌移植组1、粪菌移植组3分别有2种、1种菌门与对照组差异有统计学意义(P<0.05);但粪菌移植组2与对照组相比差异无统计学意义。属水平上，粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3分别有6种、2种、5种菌属与对照组差异有统计学意义(P<0.05),粪菌移植组2与对照组存在差异的菌属最少，其属水平菌群组成与对照组最接近。结论粪菌移植有助于恢复经抗生素干预后的小鼠肠道菌群结构，不同移植频率及移植时间对抗生素预处理小鼠肠道菌群的恢复效果不同，以1次/天、持续2周的粪菌移植效果较好。

关键词：
微生物
抗生素
粪菌移植
肠道微生态
肠道菌群失调
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人体肠道中栖息着数以百亿计的微生物，这些肠道微生物主要是细菌。肠道细菌通过共生、拮抗等方式互相制约、互相依存，从而构成复杂的动态平衡的生态体系即肠道菌群，对维持人体健康起着至关重要的作用[1]。健康的肠道菌群在调节代谢及免疫、提供营养、维持肠道屏障功能等方面发挥重要作用。反之，肠道菌群一旦发生紊乱，将会对机体健康产生危害。

粪菌移植(fecal microbiota transplantation, FMT)是将健康人粪便中的正常菌群移植到患者胃肠道中，以恢复患者正常的肠道微生态，从而对治疗疾病起到积极作用[2]。粪菌移植具有广泛的治疗前景，近年来，关于粪菌移植的研究蓬勃发展，临床上已经将粪菌移植作为治疗艰难梭菌感染的重要方式。抗生素预处理是粪菌移植的一个必要过程，大量研究证实，抗生素预处理可以增加粪菌移植的成功率，选择混合抗生素可以尽量减少肠道中的微生物数量和种类，为后续移植提供一个适宜的肠道环境[3]。尽管粪菌移植已经被广泛应用于研究疾病模型中的因果关系，但在供体粪便采集、受体给药途径、剂量、时间等方面尚没有相关的标准方案，粪菌移植的剂量和频率可能会影响菌群的恢复情况。

本研究选用混合抗生素对C57BL/6J小鼠干预2周，再进行粪菌移植，探究不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群恢复的影响，以期获得最优移植方案。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

氨苄西林、新霉素、杆菌肽、万古霉素、亚胺培南和两性霉素B购于大连美仑生物有限公司；粪便基因组DNA提取试剂盒，天根生化(北京)科技有限公司；台式高速离心机，上海力康生物医疗科技有限公司；组织研磨仪，北京华越洋生物科技有限公司。

1.2实验动物及分组处理

10周龄C57BL/6J雄性小鼠24只，体重18～22 g,购于北京华阜康有限公司，动物合格证号SCXK(京)2019-0008。于四川大学华西公共卫生学院实验动物中心饲养，许可证号SYXK(川)2018-011,室温(25±2)℃,相对湿度50%～70%,12 h昼夜循环，自由饮水摄食。本研究通过饲养单位伦理审查(No. Gwll2022058),所有实验程序均按照四川大学华西公共卫生学院动物实验指导方针进行。

小鼠按体重分层随机分为4组，即对照组、粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3。对照组小鼠作为粪菌移植供体，不进行干预。粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3均灌胃混合抗生素(200μL/d)2周，随后灌胃粪菌悬液(200μL/d)。粪菌移植组1灌胃粪菌悬液1次/天，持续1周；粪菌移植组2灌胃粪菌悬液1次/天，持续2周；粪菌移植组3灌胃粪菌悬液3次/周，持续2周。粪菌移植方法见参考文献[4]。实验结束后采集小鼠粪便，冻存于-80℃冰箱中备用。

1.3混合抗生素的制备

使用100 mg/kg氨苄西林、新霉素、杆菌肽，50 mg/kg万古霉素、亚胺培南，1 mg/kg两性霉素B溶于无菌PBS溶液中制成混合抗生素溶液备用。混合抗生素溶液制备方法见参考文献[5]。

1.4粪菌移植液的制备

收集对照组小鼠的粪便，按照1∶5(w/v)使用无菌PBS溶液稀释。使用涡旋仪混匀，混匀后的液体4℃500 g离心5 min,收集上清。粪菌悬液现用现配，保证粪菌移植在粪便采集后2 h内完成。

1.5 16S rDNA扩增子测序和生物信息学分析

按试剂盒操作提取粪便DNA后进行PCR扩增。PCR反应程序为：98℃预变性1 min, 98℃变性10 s, 50℃退火30 s, 72℃延伸30 s,共30个循环，72℃终延伸5 min。扩增子测序和生物信息学分析由成都贝斯拜尔生物科技有限公司完成。经过拼接过滤，扩增子序列变体(amplicon sequence variants, ASV)聚类，物种注释及丰度分析，分析样本Alpha多样性、Beta多样性和物种组成的群落差异。

1.6统计学分析

使用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析，计量资料用平均值±标准差(x¯±s)描述，组间比较采用单因素方差分析(方差齐)或Kruskal-Wallis秩和检验(方差不齐),多重比较用LSD法，P<0.05认为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 ASV数量

ASV是在去除了错误序列之后，将标准设为100%进行聚类，聚成一类的序列就被视作为一个ASV。由表1可知，粪菌移植组1分类到属和种的ASV数量显著低于对照组(P<0.05),粪菌移植组2和粪菌移植组3分类到各水平的ASV数量均显著低于对照组(P<0.05)。

表1不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群扩增子序列变体(ASV)数量的影响(n=6,x¯¯±s)

基于各组样本的ASV数量绘制出了可直观显示各组差异的Venn图(图1),对照组有704个独立的ASV,粪菌移植组1有637个独立的ASV,粪菌移植组2有570个独立的ASV,粪菌移植组3有559个独立的ASV。

2.2肠道菌群Alpha多样性

Alpha多样性是指一个特定区域或生态系统内的多样性，是反映丰富度和均匀度的综合指标。由表2可知，与对照组相比，粪菌移植组1的肠道菌群Alpha多样性指数无显著变化，而粪菌移植组2、粪菌移植组3的ACE指数、Chao1指数、Observed ASVs指数均显著降低(P<0.05)。而各组Shannon指数和Simpson指数间的差异没有统计学意义。

图1不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群扩增子序列变体(ASV)数量的影响 2.3肠道菌群Beta多样性

从图2主坐标分析图(principal coordinates analysis, PCOA)中可以看出，主成分1具有28.45%的解释度，主成分2具有20.14%的解释度；对照组与粪菌移植组1、粪菌移植组2、粪菌移植组3的肠道菌群结构存在明显的差异，粪菌移植组1与粪菌移植组2、粪菌移植组3之间也存在明显差异。粪菌移植组2和粪菌移植组3则更为接近对照组。

表2不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群Alpha多样性的影响(n=6,x¯¯±s)

图2不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群Beta多样性的影响下载原图

2.4肠道菌群物种组成

2.4.1门水平

从图3、表3中可知，与对照组相比，粪菌移植组1拟杆菌门的相对丰度显著降低，放线菌门显著增加(P<0.05);粪菌移植组2无显著变化；粪菌移植组3的拟杆菌门相对丰度显著降低(P<0.05)。各组的厚壁菌门和拟杆菌门的比值(F/B)无显著差异。

2.4.2属水平

表4展示了在属水平上占比前八位的菌属的相对丰度，与对照组相比，粪菌移植组1的毛茛菌属(Muribaculaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著降低(P<0.05),阿克曼菌属(Akkermansia)、杜氏杆菌属(Dubosiella)、拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著增加(P<0.05);粪菌移植组2的乳杆菌属(Lactobacillus)、另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著降低(P<0.05);粪菌移植组3的毛茛菌属(Muribaculaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)、另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著降低(P<0.05),杜氏杆菌属(Dubosiella)、梭菌属(Clostridia_UCG-014)相对丰度显著增加(P<0.05)。粪菌移植组2属水平菌群组成与对照组最接近。

图3不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群门水平物种丰度的影响

表3不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群门水平物种丰度的影响(n=6,x¯¯±s)

由图4可见，与粪菌移植组1相比，粪菌移植组2的拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著降低(P<0.05),乳杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、另枝菌属(Alistipes)相对丰度显著增加(P<0.05);粪菌移植组3的阿克曼菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Bacteroides)相对丰度显著降低(P<0.05),乳杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)相对丰度显著增加(P<0.05)。粪菌移植组2、粪菌移植组3的乳杆菌属(Lactobacillus)、毛螺菌属(Lachnospiraceae_NK4A136_group)、阿克曼菌属(Akkermansia)、拟杆菌属(Bacteroides)恢复情况好于粪菌移植组1。

表4不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群属水平物种丰度的影响(n=6,x¯¯±s)

图4不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群属水平物种丰度的影响

3、讨论

利用粪菌移植来恢复肠道菌群功能的记载在我国可追溯至东晋时期。VAN NOOD等[6]开展的随机对照试验显示，粪菌移植对复发性艰难梭菌结肠炎有效，粪菌移植组的复发率低于抗生素组。粪菌移植治疗这些疾病的优势在于重建患者的肠道菌群，经过移植后，菌群多样性指标及物种组成状况显著改善。本研究在肯定粪菌移植功效的基础上进一步探究移植频率及移植时间对肠道菌群恢复的影响。

粪菌移植组1、粪菌移植组2及粪菌移植组3中出现较多独立的ASV,说明混合抗生素干预后再进行粪菌移植，小鼠的肠道菌群得到了重新构建。

Alpha多样性主要与两个因素有关：一是种类数目，即丰富度；二是多样性，即群落中个体分配上的均匀性。群落丰富度指数主要包括Chao指数和ACE指数，群落多样性指数包括Shannon指数和Simpson指数。粪菌移植各组ACE指数和Chao1指数均降低，粪菌移植组2和粪菌移植组3的降低趋势较粪菌移植组1更明显。从这一角度来看，粪菌移植组1的效果似乎更好，但这没有考虑物种丰度，因为Shannon指数和Simpson指数在粪菌移植后并没有发生显著变化。

Beta多样性分析是不同生态系统之间多样性的比较，通过二维坐标图反映样品间是否有显著的微生物群落组成差异。有研究表明粪菌移植可以重构小鼠肠道菌群，经粪菌移植后，小鼠Beta多样性组内差异变小[7]。本研究发现粪菌移植组与对照组之间出现明显的组间差异，粪菌移植组在抗生素预处理后其肠道菌群结构得到重建；其中，粪菌移植组2及粪菌移植组3更接近对照组水平，且粪菌移植组2各样品更为聚集，存在更小的组内差异。因此，可认为粪菌移植持续2周的恢复效果好于1周，每天移植的效果好于每周3次。

肠道菌群主要由厚壁菌门、拟杆菌门、放线菌门、变形菌门、梭菌门和疣状菌门构成，其中厚壁菌门和拟杆菌门占肠道菌群的90%以上。LIMKETKAL等[8]发现，粪菌移植后厚壁菌门和拟杆菌门占比增加，变形菌门占比下降，本研究结果与之一致。进一步比较不同移植周期的效果发现，粪菌移植1周与2周的效果不同。粪菌移植2周后，三大菌门的相对丰度恢复情况好于粪菌移植1周；移植相同时间时，每天移植粪菌小鼠的三大菌门相对丰度与对照组已经没有统计学差异，且各菌门的相对丰度更接近对照组，说明每天移植粪菌的效果好于每周3次移植。

粪菌移植前后属水平的物种丰度会发生变化，尤其是阿克曼菌属在粪菌移植后会明显上升。本研究发现，粪菌移植1周与2周条件下属水平物种丰度的变化明显不同。移植2周时，一些关键菌属如乳酸杆菌属、阿克曼菌属、拟杆菌属、毛螺菌属等的相对丰度的恢复效果要明显好于移植1周。乳酸杆菌作为潜在的肠道益生菌，对肠道健康有重要作用，长期补充乳酸杆菌属对儿童食物过敏具有较好的预防作用[9]。阿克曼菌作为新开发的益生菌，可以通过调节肠道内黏液厚度、维持肠道屏障完整性从而改善代谢和免疫功能，防治Ⅰ型糖尿病、酒精性脂肪肝、恶性肿瘤等疾病[10]。毛螺菌属、拟杆菌属均属于丁酸产生菌，通过测定它们的丰度可以评价肠道菌群的稳态和机体的健康状况。这些研究结果均说明粪菌移植2周的效果好于粪菌移植1周。在粪菌移植组2中，仅有两种菌属的相对丰度与对照组存在统计学差异，少于粪菌移植组1和粪菌移植组3,此外，粪菌移植组2小鼠的毛茛菌属(Muribaculaceae)、杜氏杆菌属(Dubosiella)、梭菌属(Clostridia_UCG-014)的相对丰度更接近对照组。说明粪菌移植组2的移植效果优于粪菌移植组1和粪菌移植组3。

综上，本研究发现，粪菌移植有助于抗生素预处理小鼠的肠道菌群恢复，主要体现在物种多样性和相对丰度的恢复。总体而言，粪菌移植2周的效果好于1周，每天移植的效果好于一周3次移植。

参考文献:

[7]盖晓伟粪菌移植重建脓毒症小鼠肠道菌群及其对肠粘膜屏障的保护作用[D].石家庄:河北医科大学, 2020.

文章来源:周志谟,张瑜杰,刘美汛等.不同粪菌移植周期对抗生素预处理小鼠肠道菌群恢复的影响[J].卫生研究,2023,52(04):585-590.