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人参皂苷Rg1拮抗亚砷酸钠诱导C57BL/6小鼠肾毒性研究

2023-08-15 93 上传者：管理员

摘要：探讨人参皂苷Rg1对亚砷酸钠（SA）诱导小鼠肾脏毒性的干预效应。方法 20只雄性健康C57BL/6小鼠采用随机数字表法均分为对照组（给予去离子水灌胃）、SA染毒组（10.0μg/g SA进行灌胃）、人参皂苷Rg1+SA染毒组（20.0μg/g人参皂苷Rg1在SA染毒前8 h腹腔注射+10.0μg/g SA灌胃）、人参皂苷Rg1对照组（20.0μg/g人参皂苷Rg1腹腔注射）。以上各组均隔天给予相应处理1次，持续14 d。HE染色观察肾组织病理改变并进行肾小管损伤（TI）评分；酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清肌酐（Scr）和肾组织谷胱甘肽（GSH）、血红素加氧酶-1(HO-1)、丙二醛（MDA）含量；免疫印迹试验检测肾组织HO-1、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、泛素结合蛋白P62(SQSTM1/p62)、unc-51样激酶-1(ULK1)和微管相关蛋白轻链3B(LC3-B)表达水平；免疫荧光染色检测LC3-B水平。结果与对照组相比，SA染毒组小鼠TI评分、Scr和肾组织MDA、ULK1和LC3-B表达水平升高，肾组织GSH和HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62表达水平降低（P<0.05），呈红色斑点的LC3-B染色强度增强、增多；与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组TI评分、Scr和肾组织MDA、ULK1和LC3-B表达水平降低，而GSH、HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62表达水平升高（P<0.05）,LC3-B免疫荧光染色强度减弱、减少。结论人参皂苷Rg1拮抗SA诱导的小鼠肾毒性，可能与HO-1信号激活和细胞自噬抑制有关。

关键词：
人参皂苷Rg1
砷中毒
肾毒性
自噬
血红素加氧酶-1
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砷在环境中通常以三价化合物形式存在，可污染土壤、饮用水和农作物，在一定条件下暴露于机体，可导致肾小球或肾小管组织病理学损伤、肾功能障碍[1,2]。既往研究发现，砷暴露可诱导骨肉瘤细胞或鸡睾丸组织细胞凋亡和自噬，与细胞内蛋白激酶B(protein kinase B,Akt/PKB）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin,m TOR）信号通路抑制有关，而活性氧（ROS）清除剂可明显拮抗砷的毒性效应[3,4]。中药人参（Panax ginseng C.A.Mey.）属于五加科的多年生草本植物，其主要生物活性成分是人参多糖和人参皂苷。研究发现，人参多糖提取物具有抗氧化作用，能有效减轻顺铂诱导的小鼠急性肾损伤[5]。人参皂苷Rg1是人参主要药物活性成分提取物，目前市售最为常见。其除增强机体的抗氧化活性外[6]，还具有激活m TOR信号通路[7]、抗炎、抑制细胞凋亡和自噬的作用[8,9]。目前，人参皂苷Rg1对砷诱导肾毒性的干预效应尚不清楚。本研究旨在探讨人参皂苷Rg1对亚砷酸钠（sodium arsenite,SA）诱导小鼠肾毒性的拮抗效应及机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

20只雄性SPF级C57BL/6小鼠购自湖南长沙斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号：SCXK（湘）2019-0004，使用许可证号：SYXK（湘）2019-0017。小鼠体质量24.1～26.8 g，平均（25.2±1.1)g,9～10周龄。在标准饲养条件（12 h光照/黑暗、温度20～22℃和相对湿度60%～70%）适应性喂养1周。

1.2主要试剂及仪器

亚砷酸钠（Na As O2）购自美国Sigma-Aldrich公司；人参皂苷Rg1购自上海笃玛生物科技有限公司；血清肌酐（Scr）酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海笃玛生物技术有限公司；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione,GSH）、血红素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1）酶联免疫吸附试验（ELISA）试剂盒均购自上海酶联生物科技有限公司；RIPA裂解缓冲液购自美国Bio Vision公司；Bradford试剂购自美国Sigma-Aldrich公司；兔单克隆HO-1抗体、兔单克隆m TOR抗体与磷酸化m TOR抗体（p-m TOR）、兔多克隆酵母自噬基因Atg1同源物unc-51样激酶-1(unc-51-like kinase-1,ULK1）抗体、泛素结合蛋白p62(sequestosome 1,SQSTM1/p62）抗体、微管相关蛋白轻链3B(microtubule associated protein light chain 3B,LC3-B）抗体均购自英国Abcam公司；兔抗辣根过氧化物酶（HRP）标记Ig G二抗购自美国LSBio公司；化学发光试剂盒购自上海碧云天生物公司；酶标仪购自美国Bio Tek公司；Motic光学显微镜购自麦克奥迪公司。

1.3分组

采用随机数字表法将小鼠分为4组，每组5只。对照组：给予去离子水灌胃，隔天1次，持续14 d;SA染毒组：Na As O2溶于去离子水，参考文献[10,11]及大小鼠等效剂量换算比值，以10.0μg/g剂量进行灌胃，隔天1次，持续14 d；人参皂苷Rg1+SA染毒组：参考文献[12,13]，以人参皂苷Rg1 20.0μg/g，在SA染毒前8 h进行腹腔注射干预，然后给予SA10.0μg/g灌胃处理；人参皂苷Rg1对照组：人参皂苷Rg1用去离子水稀释，以20.0μg/g剂量腹腔注射，隔天1次，持续14 d。实验结束时，腹腔注射0.9%戊巴比妥钠麻醉小鼠并实施安乐死，立即收集血液和肾组织进行分析。本动物研究方案经贵州医科大学伦理委员会批准（批准号：1900222），根据动物实验：报告体内实验（Animal Research:Reporting of in vivo Experiments,ARRIVE）指南的原则执行本实验方案。

1.4肾功能和组织病理学评价

取0.5 m L血后以4℃、400 r/min离心5 min，根据ELISA试剂盒操作说明检测上清液Scr含量。肾组织经4%多聚甲醛固定72 h后，用石蜡包埋以制备5μm病理切片，然后在显微镜下行苏木精-伊红（HE）染色，并进行肾小管损伤（TI）评分[14]。TI定义为：肾小管扩张，管状上皮肿胀，细胞呈空泡样或颗粒样变性、坏死，刷状缘缺失或呈管型结构。通过显微镜观察肾组织切片中肾小管病变区域，评估每个高倍视野下病变区域的损伤面积百分率（%），每张切片计算10个高倍视野下TI评分平均值。

1.5 ELISA检测肾组织HO-1、GSH和MDA含量

肾组织分离并称质量，按1∶9质量体积比比例加入磷酸盐缓冲液（PBS）配制成0.1 g/m L，使用匀浆器进行匀浆，然后加入RPMI培养基（含有0.05%Ⅱ型胶原酶，0.002%DNaseⅠ和0.6%胎牛血清），37℃下孵育30 min后，进行3次冻融循环以裂解肾组织细胞。最后，组织匀浆液4℃冷冻离心10 min(1 500 r/min），收集上清液，参照ELISA试剂盒操作说明书，使用酶标仪在450 nm波长下测量光密度（OD）值，并根据标准曲线将OD值转换为肾组织MDA、GSH和HO-1含量。

1.6免疫印迹试验检测肾组织HO-1、p-m TOR、ULK1、SQSTM1/p62和LC3-B表达

肾组织分离后加入RIPA裂解缓冲液以裂解细胞提取总蛋白，使用Bradford试剂测定蛋白质浓度，肾组织样品通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳并转移到聚乙烯亚胺（PVD）膜上。随后使用5%脱脂奶粉室温摇床封闭2 h以阻断非特异性结合位点后，将膜与HO-1(1∶1 500）、p-m TOR(1∶1 000）、m TOR(1∶1 500）、ULK1(1∶500）、SQSTM1/p62(1∶800）、LC3-B抗体（1∶400）于4℃孵育16 h。TBS-T缓冲液洗膜3次后，加入二抗HRP Ig G室温孵育2 h，然后加入化学发光显影试剂成像。通过目标靶蛋白与抗β-肌动蛋白内参抗体的吸光度比值来评估靶蛋白表达相对水平。

1.7免疫荧光染色检测LC3-B表达

肾组织分离后加入4%多聚甲醛溶液，4℃过夜固定，制备5μm切片，切片经脱蜡、水化、洗涤后，进行高压抗原修复和山羊血清封闭，然后与LC3-B一抗在4℃孵育过夜。PBS缓冲液洗涤3次后，与HRP标记Ig G二抗在37℃孵育40 min,PBS再次洗涤3次，然后在室温下用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）复染5 min，再次洗涤切片后，通过共聚焦显微镜（Leica TCS-SP5）进行荧光成像观察（Alexa Fluor®555发射波长为535 nm,DAPI发射波长为340 nm）。

1.8统计学方法

采用SPSS 23.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1各组肾脏组织病理损伤比较

对照组肾组织形态正常，肾小管上皮细胞核膜光滑，细胞质染色均匀，核质比正常，细胞间距正常；与对照组相比，SA染毒组肾小球球囊增大，毛细血管充血，肾小管管腔不规则，小管上皮细胞水肿，部分核消失，Scr和TI评分明显升高（P<0.05）。与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组肾小球毛细血管充血、肾小管上皮细胞和肾间质水肿改善，Scr和TI评分下调（P<0.05）。人参皂苷Rg1对照组肾组织形态正常，与对照组类似。见图1、表1。

图1 SA染毒及人参皂苷Rg1预处理干预后肾脏组织病理学特征（HE染色，×100)

2.2各组肾组织氧化应激指标比较

与对照组相比，SA染毒组小鼠肾组织GSH和HO-1表达水平降低，MDA表达水平升高（P<0.05）；与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组小鼠肾组织GSH和HO-1细胞水平升高，而MDA细胞水平降低（P<0.05），见表1。

2.3各组肾组织中HO-1、p-mTOR、SQSTM1/p62、ULK1和LC3-B水平比较

与对照组相比，SA染毒组小鼠肾组织中HO-1、p-m TOR和SQSTM1/p62表达水平降低，ULK1和LC3-B表达水平升高（P<0.05）。与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组HO-1、p-m TOR和SQSTM1/p62水平上调，ULK1和LC3-B水平降低（P<0.05），见图2、3，表2。肾组织免疫荧光染色显示，与对照组相比，SA染毒组小鼠肾组织呈红色斑点的LC3-B染色强度增强、增多。与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组显示LC3-B免疫荧光染色强度减弱、减少，见图4。

图2各组肾组织HO-1和p-mTOR免疫印迹特征

图3各组肾组织SQSTM1/p62、ULK1和LC3-B免疫印迹图

3、讨论

砷是一种环境中广泛存在的高毒性致癌物，通常由于含砷矿开采冶炼、含砷农药生产使用等活动导致环境砷污染，通过直接接触或食物链摄入过量砷可导致急慢性砷中毒发生，产生肝、肾、皮肤、神经系统等多器官损害效应[15]。本研究发现，急性砷暴露可导致小鼠肾脏组织病理损伤，表现为Scr、肾小管损伤评分和氧化应激产物MDA水平升高，而肾组织抗氧化剂GSH和HO-1含量降低，提示氧化应激在砷致肾毒性中扮演着重要的角色。人参作为一种广泛使用的传统中药，其生物活性提取物富含与多糖结合的甾体皂苷，其用于中枢神经系统、代谢、感染和肿瘤等疾病治疗已有约5 000年历史[16]。研究发现，人参皂苷Rg1具有上调GSH和下调MDA的抗氧化应激效应[17]，具有抑制小鼠NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3,NLRP3）炎症信号激活及改善肾脏衰老期肾小球纤维化效应[18]。Fan等[19]发现，人参皂苷Rg1可拮抗D-半乳糖诱导的小鼠亚急性肾组织损伤。Guo等[20]发现人参皂苷Rg1可通过抑制肾小管上皮细胞铁死亡而改善脓毒症诱导的急性肾损伤。本研究中，与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1干预+SA染毒组小鼠肾组织损伤程度明显减轻，Scr、肾小管损伤评分和肾组织MDA水平降低，HO-1和GSH水平升高，而自噬标志物ULK1和LC3-B水平降低以及自噬反应底物SQSTM1/p62蛋白水平升高，提示HO-1激活、自噬抑制与人参皂苷Rg1拮抗砷诱导小鼠肾毒性效应有关。

表1各组血清肌酐、TI评分和MDA、GSH、HO-1含量比较

表2各组肾组织HO-1、p-m TOR、SQSTM1/p62、ULK1和LC3-B水平比较

图4肾组织自噬标志物LC3-B的免疫荧光染色图（免疫荧光染色，×400)

HO-1是机体内广泛分布的一种重要的抗氧化酶，与细胞内丝氨酸或苏氨酸激酶家族m TOR信号激活有关。乙醇可诱导人食管鳞癌细胞HO-1水平上调，伴随着p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和m TOR信号激活[21];HO-1可与甾醇异构酶相互作用，从而激活m TOR信号通路以减轻胆固醇诱导的心肌细胞缺氧[22]。m TOR信号通路激活后，可磷酸化ULK1第757位丝氨酸并阻止ULK1激活，破坏ULK1与腺苷酸活化蛋白激酶的相互作用，从而抑制细胞自噬[23]。反之，m TOR信号抑制可导致下游靶p70核糖体蛋白S6激酶和真核起始因子4E结合蛋白1磷酸化抑制，导致细胞内基因-蛋白质翻译减少、细胞生长周期及细胞增殖抑制，从而激活细胞自噬[24]。在青蒿琥酯染毒的类风湿性关节炎小鼠模型中，抑制m TOR信号通路可加速软骨细胞自噬[25]。本研究发现，与SA染毒组相比，人参皂苷Rg1+SA染毒组肾组织p-m TOR水平升高，因此推测人参皂苷Rg1可诱导HO-1介导的m TOR信号激活，促进细胞生长及增殖、抑制肾组织细胞自噬以改善SA诱导的肾组织损伤。

综上，本研究发现人参皂苷Rg1通过激活HO-1信号介导抗氧化应激，并激活m TOR信号介导的细胞自噬抑制效应减轻SA诱导小鼠肾脏病理损伤。目前，人参皂苷Rg1拮抗砷诱导的肾毒性作用机制尚未完全清楚，人参皂苷Rg1激活HO-1和m TOR信号通路以及抑制细胞自噬的分子调控机制需要进一步探索。

基金资助:国家自然科学基金资助项目(81960597);贵州省科学技术基金项目[2020]1Y359;

文章来源:杨渊,宋爽,陈容等.人参皂苷Rg1拮抗亚砷酸钠诱导C57BL/6小鼠肾毒性研究[J].天津医药,2023,51(08):820-824.