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健脾五穴点按法对老年功能性便秘大鼠的影响

2023-11-10 46 上传者：管理员

摘要：目的探讨健脾五穴点按法治疗老年功能性便秘(FC)的影响因素。方法 40只Wistar大鼠，按体质量随机分为空白组、模型组、穴位按压组、阳性药物组，采用复方地芬诺酯混悬液建立FC大鼠模型。空白组、模型组不做干预治疗；穴位按压组采用健脾五穴按压治疗；阳性药物组采用莫沙必利溶剂灌胃。实验结束后，进行首粒黑便排出时间及粪便含水率检测，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测血清5-羟色胺(HT)和血管活性肠肽(VIP)含量，实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)检测结肠组织P物质(SP)mRNA和促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)mRNA水平，Western印迹检测结肠SP和CRF蛋白水平。结果治疗7 d后，各组首粒黑便排出时间比较：模型组>穴位按压组>阳性药物组(均P<0.05);模型组粪便含水率、5-HT、SP、CRF mRNA和蛋白水平明显低于穴位按压组、阳性药物组，模型组VIP水平明显高于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05)、穴位按压组和阳性药物组粪便含水率、5-HT、VIP、SP、CRF mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论健脾五穴点按压对FC大鼠脑肠肽的紊乱具有调节作用，促进了大鼠排便，改善了功能性便秘症状。

关键词：
代谢功能障碍
健脾五穴
功能性便秘
按压治疗
点按法
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功能性便秘(FC)是指无代谢功能障碍、无结构异常变化、无器质性病因，出现的以排便次数减少、大便干结、排便无力为主要症状的临床病症[1]。属于中医学“便秘”“脾约”范畴，是社区生活中较为常见的功能性疾病[2]。流行病学显示，我国成年人FC的发病率为4%～6%,年龄越大，发病率越高[3]。长期便秘会引起腹胀、食欲下降、口内异味等症状，便秘产生的有害物质亦会增加患者并发胃肠道疾病的风险[4]。健脾五穴点按法治疗老年FC,有着较好的临床疗效，但作用机制不明。因此，本研究主要是立足于对健脾五穴的实验机制研究，围绕“脑-肠轴”调节FC的关键作用，探讨健脾五穴点按法治疗老年FC的作用机制。

1、材料与方法

1.1实验动物

SPF级，Wistar大鼠40只，雌雄各半，9月龄，体质量300～350 g,购于长春市亿斯实验动物技术有限责任公司[许可证号码：SCXK(吉)-2020-0002]。适应性喂养1 w,雌雄分笼，每笼5只，摄食饮水不限，自然照明，保持环境温度22～24℃,湿度55%～60%。

1.2药品及试剂

莫沙必利片，5 mg/片，国药准字J20110022。复方地芬诺酯片(康普),2.5 mg/片，国药准字H32022716。大鼠5-羟色胺(HT)、人血管活性肠肽(VIP)酶联免疫试剂盒(96T;组织匀浆；上海茁彩生物科技有限公司，ZC35959J,ZC37398)。总RNA提取试剂(ml095476)、HG TaqMan miRNA反转录试剂盒(ml095527)、DNA Marker 2000(ml095609)、P物质(SP)兔抗多克隆抗体(ml091754)、促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)兔抗单克隆抗体(ml091933)均购自上海酶联生物科技有限公司；β-actin鼠抗单克隆抗体(北京安诺伦生物科技有限公司，YM3029);阿拉伯树胶粉(天津市光复精细化工研究所);异氟烷(上海玉研科学仪器有限公司);98%氯苯丙氨酸(PCPA,上海麦克林生化科技股份有限公司)。

1.3仪器设备

气麻仪(上海玉研科学仪器有限公司，MR7654);9 cm鍉针(宸之瑞办公专营店);酶标仪(BIOTEK,ELX-800);电泳仪(DYY-7C)、转移槽(DYCZ-40D)、水平摇床(WD-9405B)均购自北京六一生物科技有限公司；实时荧光定量-聚合酶链反应(PCR)仪(Applied Biosystems, ABI7500)、超速冷冻离心机(湖南湘仪，H-2050R);电热恒温培养箱(天津泰斯特；DH36001B);离心机(益世科生物科技有限公司，MCR-88-8)。

1.4动物分组及造模

40只Wistar大鼠，喂养7 d后，分为雌雄两笼，每笼20只，按体质量随机分为空白组、模型组、穴位按压组、阳性药物组，每组10只，雌雄分笼各半。空白组给予2%蔗糖灌胃，其余各组采用复方地芬诺脂混悬液建立FC大鼠模型，将复方地芬诺酯片溶解稀释后按大鼠10 mg/kg灌胃，每天1次，连续14 d,当大鼠出现首粒黑便排出时间延长时，为FC模型造模成功。

1.5实验动物干预及取材

空白组、模型组：每日正常饮食饮水，不做干预治疗。穴位按压组：采用9 cm鍉针进行健脾五穴按压治疗，大鼠治疗前采用气麻仪固定在鼠板上，以鍉针垂直在大鼠神阙、中脘、章门(左右)、天枢(左右)和气海进行点按，力度以鍉针自身重力为最大值，每日1次，连续治疗7 d。大鼠穴位定位参照文献[5]。阳性药物组：将莫沙必利溶解稀释后按人鼠比例1∶30进行等效剂量换算灌胃(每100 g大鼠给予25 mg药物),每日1次，连续7 d。干预结束后，禁食24 h。麻醉成功后，经腹主动脉采血5 ml,从降结肠与乙状结肠交界处向上取50 mm×3 mm×3 mm肠组织，分别存于-80℃冰箱冻存备用。

1.6首粒黑便时间及粪便含水率检测

分别于造模14 d及治疗7 d清晨给水30 min后，给予10 ml/kg的墨汁灌胃，记录每只大鼠墨汁灌胃时间及各组大鼠的首粒黑便排出时间。粪便含水率(%)=(粪便湿重-粪便干重)/粪便湿重×100%。

1.7血清酶联免疫吸附试验(ELISA)

检测大鼠血清5-HT和VIP的含量。按ELISA试剂盒说明测定各组大鼠血清5-HT和VIP的含量。建立标准曲线的直线回归方程式，计算出每个样品5-HT和VIP的含量。

1.8结肠组织PCR检测

将结肠组织置于离心管中，加入TRNzol总RNA提取试剂进行总RNA提取，采用分光光度计测定样品浓度和纯度，逆转录合成cDNA,随后进行PCR。SP:上游引物5′-GCATTGCCTCCTTGATTTGG-3′,下游5′-TGGCGGTC-TTTTT TCTCGTT-3′,81 bp; CRF:上游引物5′-TCTCTGGATCTCACCTTCCACCTT-3′,下游5′-AGTTTCCTGTTGCTGTGAGCTTGC-3′,92 bp; (引物由美国Invitrogen生物技术有限公司合成，以GAPDH为内参),数据采用RQ=2-ΔΔCt法计算相对表达量。

1.9 Western印迹

检测结肠组织中SP、CRF蛋白表达。采用二喹啉甲酸(BCA)法进行蛋白定量，完成蛋白提取、定量、电泳、转印、封闭、抗体孵育、底物发光等，完成胶片扫描，采用图像处理系统(Gel-Pro-Analyzer软件)分析目标条带及光密度值。蛋白的相对含量以目的蛋白灰度值与β-actin灰度值的比值表示。

1.10统计学方法

采用SPSS19.0软件进行方差分析、t检验。

2、结果

2.1各组治疗7d后首粒黑便排出时间及粪便含水率比较

治疗7 d后，各组首粒黑便排出时间比较：模型组>穴位按压组>阳性药物组(均P<0.05);模型组粪便含水率明显低于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组粪便含水率差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 ELISA检测各组5-HT、VIP水平

模型组5-HT明显低于穴位按压组、阳性药物组，模型组VIP水平明显高于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组5-HT、VIP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 PCR检测各组结肠组织SP、CRF mRNA和蛋白水平

模型组SP、CRF mRNA和蛋白水平明显低于穴位按压组、阳性药物组(均P<0.05),穴位按压组和阳性药物组SP、CRF mRNA和蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1和图1。

表1各组治疗7 d后首粒黑便排出时间、粪便含水率、血清5-HT、VIP和SP、CRF mRNA及蛋白水平比较

图1 Western印迹检测各组结肠组织SP、CRF蛋白表达

3、讨论

FC是消化系统常见的功能性胃肠道疾病，发病机制尚未完全明确。西药治疗主要以刺激性泻药为主，效果欠佳，容易反复，长期便秘发作甚至会诱发心脑疾病[6]。中医治疗疗效确切持久、治病求本、历史悠久，副作用少，有独特的优势，中医学家认为FC的病因病机主要从脾胃论治，常兼其他脏腑病变[7]。治疗方法有中药方剂内服施治、中医外治两类。中药根据临床症状、舌脉表现，四诊合参进行辨证分型施治，效果显著。外治方法多样化，以针灸治疗、穴位贴敷、穴位注射、推拿疗法、中药灌肠为主，疗效显著[8]。健脾五穴，是中医腹部按摩常用的推拿选穴。选穴包括神阙、中脘、章门、天枢、气海。神阙是骆竞洪九宫腹部推拿中的中宫，善于运气健脾，调畅气机；中脘、章门，一脏会一腹会，是脏腑点穴中两个合用穴；气海有提气健脾之法，临床效果颇为明显；天枢为天地交接之处、气机转输之纽，点按此穴有利于助气海，运气下行。健脾五穴点按法治疗老年FC临床疗效较好，但因缺少有效的机制支撑，故阻碍了有效的临床推广及应用。近年来研究发现，“脑-肠轴”调节失衡在FC发病过程中扮演了重要的角色，该学说正逐渐成为FC机制研究的新热点[9]。相关研究表明，5-HT、VIP、SP、CRF等脑肠肽的表达差异可影响患者的胃肠排空功能和肠蠕动，并与FC的发病密切相关[10]。本研究在以往临床研究及动物研究的基础上，结合现代理化技术、模型技术、动物治疗技术等，开展针对健脾五穴点按法治疗老年FC大鼠影响的研究，从“脑-肠轴”调节上阐述健脾五穴对老年FC的影响作用。

综上，经健脾五穴按压治疗后，提高了FC大鼠结肠组织中SP、CRF mRNA表达和蛋白活性，对脑肠肽的紊乱具有调节作用，促进了大鼠排便，改善了FC症状。

参考文献:

[1]汤水华,李思汉,林翔英,等.理气通便方对功能性便秘带证大鼠脑肠腻的影响[J].北京中医药大学学报,2021:44(7):615-24.

[2]张雨柔,隋楠.中医药干预功能性便秘肠道菌群影响的研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2023;25(8):26-9.

[3]马倩莹,何新芳.温针灸八穴治疗阳虚型慢性功能性便秘的临床研究[J].广州中医药大学学报,2023:40(2):363-7

[4]李燕凤,刘娜,冯敏持肠道实热型小儿便秘应用推拿治疗的效果分析[J].中国继续医学教育,2021;13(20):177-80

[5]丛德统,唐成林.实验推拿学[M].北京:科学出版社,2019:171-5.

[7]顾志坚,林江,丛军.芍药对复方地芬诺醒致便秘模型大鼠的影响[J].中医学报,2021;36(7):1501-5.

[8]陈静,吕文良.中医药防治功能性便秘研究进展[J].辽宁中医药大学学报,2021;23(6):134-40.

基金资助:吉林省教育厅科学技术研究项目(JJKH20220612KJ);

文章来源:史勇,李成浩,张红石.健脾五穴点按法对老年功能性便秘大鼠的影响[J].中国老年学杂志,2023,43(21):5289-5291.