国际癌症研究机构在GLOBOCAN报道了2020年全球最新癌症情况，全年全球约1 930万新发癌症病例和1 000万癌症死亡病例，癌症是一项世界性关注的重大健康问题，其发病率仅次于心血管疾病[1]。癌症治疗的主要技术包括药物治疗、手术治疗以及放疗，但在众多科研工作者的努力下，涌现了许多新型的治疗手段，例如靶向治疗、生物治疗以及新型辅助联合治疗等，其中肿瘤免疫治疗取得了显著的效果。既往治疗是为了“祛邪”,而免疫治疗属于“扶正”,主要通过激活或调动机体自身免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免疫力，清除残留肿瘤从而提高晚期患者生存率[2]。尽管临床试验取得了可喜的效果，但仍然有些问题需要解决，如临床稳定性低、免疫相关副作用和异常临床反应等[3]。为了克服免疫治疗耐受性，抑制性肿瘤微环境(inhibition tumor microenvironment, ITME)受到了越来越多研究者关注，肿瘤微环境中含有多种抑制性细胞群，其中肿瘤相关巨噬细胞(tumor associated macrophages, TAMs)可作为肿瘤免疫治疗的新靶点[4]。

1、肿瘤微环境和TAMs

癌症被认为是一种肿瘤细胞和肿瘤微环境之间持续动态相互作用的生态过程[5]。肿瘤微环境是由胶原蛋白和弹性蛋白纤维包裹外部的高度复杂的生态位，主要包括肿瘤中所有非癌性宿主细胞，如成纤维细胞、内皮细胞、神经元、脂肪细胞和先天性免疫性细胞，以及其细胞外基质、细胞因子、可溶性产物等非细胞成分[6]。位于肿瘤微环境中的巨噬细胞被称作为肿瘤相关巨噬细胞(TAMs),是M2样巨噬细胞的一种特殊表型，属于单核吞噬细胞系统的先天免疫细胞[7,8]。作为TME中主要浸润的免疫细胞，参与肿瘤发生、血管生成和转移、耐药性以及抗肿瘤免疫抑制[9]。巨噬细胞在不同的组织环境发生特异性分化，可分为两种不同的极化激活状态，即经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞，脂多糖和IFN-γ诱导)和交替活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞，IL-4或TGF-β诱导)[10],根据其分泌不同的细胞因子而具有相反的免疫功能(图1)。M1型巨噬细胞又称促炎性巨噬细胞，通过介导Th1型免疫反应，分泌TNF-α、IL-6和IL-12等促炎性细胞因子、细胞因子信号抑制因子3(suppressor of cytokine signaling 3,SOCS3)和趋化因子(CXCL9和CXCL10等),从而激活固有免疫细胞，达到杀灭肿瘤细胞、清除体内病原体、抑制血管生成和促进适应性免疫应答等能力[11]。M2型巨噬细胞称为抑炎性巨噬细胞，主要通过激活STAT6、PPAR-γ、SOCS2,合成分泌多种抑炎因子如IL-10和TGF-β、精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)以及CCL17、CCL22等趋化因子上调，参与Th2介导的免疫反应[12],抑制CD8+T细胞介导的免疫应答，促进肿瘤血管生成以及肿瘤细胞增殖，成为肿瘤侵袭和转移的“帮凶”[13]。除此以外，M2-TAMs还可抑制T细胞和NK细胞活性和增殖能力，促进恶性肿瘤的生长。TAMs还与TME中葡萄糖[14]、脂质[15]和谷氨酰胺[16]的代谢谱相关，肿瘤细胞利用自身代谢产物调节肿瘤浸润免疫细胞，其糖酵解所产生乳酸更利于M2-TAMs极化，由于TAM多态性和相关分子的复杂性，TAMs与肿瘤中TME相互作用需要进一步研究。

图1 TAMs的主要分类以及与肿瘤细胞相互作用机制  

2、TAM功能多样性

在肿瘤微环境中TAMs可对特定刺激产生可逆反应的能力，即转化为抑瘤M1样和促瘤M2样表型，这一可塑性导致产生TAMs的不同亚群[17]。目前研究表明，TAMs是一种无明确来源的巨噬细胞，M1/M2代表了TAMs的两种极端激活状态，常处于两种状态的持续过度态，这也凸显了TAMs的异质性和可塑性[11]。随着单细胞组学技术的出现，我们对TAMs异质性的理解发生了变化，传统的分类已经不能完全反应其复杂性，但其丰度与癌症患者临床预后的相关性已被证实[18]。CD86作为常用组织学分析巨噬细胞标记物之一，也已不具有特殊性，并在大量的RNA-seq研究中证实TAMs中富含TNF、SIGLEC1、CCL8和CSF1与低生存率有关[19]。因此，不需要定义巨噬细胞整体多样性，重要的是功能，而不是表型。TAMs的可塑性和多样性有助于解释其不同生物学功能以及潜在抗肿瘤能力，故识别TAMs中抗肿瘤和促肿瘤标记物至关重要。肿瘤是一种特殊的高炎性疾病，可能在肿瘤发展后期由M1-TAMs演变为M2-TAMs,从而发挥促肿瘤作用[20]。通常认为PI3Kγ途径和CSF-1/CSF-1R信号轴是M2-TAMs极化的重要方式[21],但通过双重阻断减少M2-TAMs数量和CD8+T细胞反应刺激，在乳腺癌[22]、甲状腺癌[23]、胶质母细胞瘤治疗中与单药相比效果无明显差异[24],故需要探索其他相关靶标如CXCL12- CXCR4、IL-12等，重编程TAMs表型来达到抑制肿瘤生长。为了更好了解TAMs在TME中激活状态和信号传递机制，需更进一步研究相关特异性标记物以及作用机制为肿瘤治疗方法提供方向。

3、针对TAMs治疗策略

以往的综述主要讨论通过清除或灭活单核细胞/巨噬细胞(如CSF-1/CSF-1R信号轴或双膦酸盐)以及抑制单核细胞/巨噬细胞向肿瘤部位募集(CCL2-CCR2信号轴)的方法来治疗肿瘤[25,26,27]。然而，大多数针对清除或灭活巨噬细胞方法主要缺点是巨噬细胞系统性和无特异靶向性，使得机体免疫系统受损削弱其防御能力。根据TAMs功能多样性显示其可采取多种方法用于治疗[28],鉴于TAMs高可塑性，迄今为止，已经出现针对TAMs的各类靶点治疗策略并处于已经完成或正在进行的动物模型实验和临床实验(表1)。这些策略主要包括两大类：一类是重新编程TAMs,通过靶向巨噬细胞极化信号通路或TAMs优势表达靶点/标记物，逆转为肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤表型；另一类是基于TAMs特定功能如吞噬作用和免疫抑制等的治疗策略以及巨噬细胞工程化改造(图2)。

图2针对TAMs的相关治疗策略 

3.1 Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)激动剂

人类基因组编码巨噬细胞和其他骨髓细胞可表达多种TLR,并识别相关病原体所威胁的分子模式。TLR激动剂可引起强烈的免疫反应，激活M1样巨噬细胞，可保护宿主免受感染，促进机体抗肿瘤免疫反应，因此TLR激动剂可作为抗肿瘤治疗中免疫佐剂。常见的TLR激动剂主要包括TLR2、TLR3、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9,均已在临床前研究中显现出治疗效果。例如常见的TLR9—是一种模式识别受体，主要位于免疫细胞内并在各类癌症中过表达如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等[29]。其配体为非甲基化胞苷磷酸鸟苷寡核苷酸(CpG oligonucleotide, CpG ODN),通过网格蛋白包被为高表达TLR9内胚体囊泡，与MyD88结构域识别启动细胞内RAK1-TRAF6复合物从而激活MAPK从触发NF-κB信号传导，增加相关细胞因子和趋化因子的分泌。TLR9激动剂(ODN1826或MGN1703)可与CTLA4或PD-1拮抗剂联合使用可提高免疫原性差的黑色素瘤小鼠免疫应答。TLR3激动剂poly(I∶C)诱导巨噬细胞极化为M1型，共同刺激CD80、CD86、CD40表达和细胞因子IL-6、IL-12和TNF-α分泌，抑制抑制性受体Tim-3,提高抗原呈递作用从而增加M1型巨噬细胞丰度而促使肿瘤消退[30]。TLR5激动剂通过TLR4信号传导诱导大量免疫细胞浸润而增强宿主抑癌反应[31]。将TLR7/8激动剂R848制备成为新型递送系统与抗PD-1联合治疗各类肿瘤时也可显著增强宿主免疫反应[32]。TLR激动剂容易受到肿瘤免疫表型变化、癌症类型和肿瘤微环境等因素的影响改变免疫治疗疗效，特别是在临床前动物实验，临床上通常结合其他免疫疗法如免疫检查点抑制剂和细胞免疫治疗等提高治疗效果[33,34]。

3.2 CCL2-CCR2轴抑制剂

在不同类型人类肿瘤中，循环单核细胞通过CCL2-CCR2信号轴从骨髓运送到肿瘤部位，增加肿瘤转移率，而肿瘤细胞通过释放CCL2将外周血中表达CCR2的单核细胞募集到肿瘤部位成熟为TAMs,加速病情进展[35]。因此，可通过阻断CCL2-CCR2轴抑制TAMs招募并增强CD8+T细胞在肿瘤微环境中的抗肿瘤效果来更大程度降低肿瘤发生率。有研究学者通过基因敲除或小分子抑制剂PF-04136309降低CCL2-CCR2信号从而抑制肿瘤生长和转移扩散[36]。该小分子药物可干扰CCL2与受体CCR2结合阻止CCR2的激活和下游的信号传导，并在一项Ib期临床实验中得到证实，联用疗法效果更为显著，也为CCL2-CCR2介导TAMs招募提供有力的临床证明[37]。其次，Carlumab在人肿瘤治疗中显示出初步抗肿瘤活性，但因短暂CCR2抑制性而限制其在临床上的使用[38]。其实CCL2-CCR2抑制剂可减少TME中抑制性免疫细胞数量特别是Treg细胞[39]。虽然越来越多的研究证据表明CCL2特异性单克隆抗体虽然可抑制TAMs募集延缓肿瘤发展，但仍然有些问题需要解决，单抗Carlumab在治疗转移性前列腺癌中并未阻断CCL2-CCR2信号轴，这一问题可能是由于TME负反馈导致CCL2增加[40]。总之，阻断CCL2-CCR2可有效抑制肿瘤生长，CCR2抑制剂可能比CCL2抗体更有效抑制TAMs募集。

表1靶向TAMs药物临床试验实例

3.3 CSF-1/CSF-1R信号阻滞剂

CSF-1是一种多生物过程的趋化因子，可诱导单核-巨噬细胞在内等多种细胞的增殖、分化，诱导其趋化活性。在鼠类乳腺癌和胶质母细胞瘤的几项临床前研究中证实，CSF-1/CSF-1R阻滞剂可减缓原发性肿瘤的生长、转移并提高荷瘤小鼠的存活率[41,42,43]。滑膜肉瘤是一种高度表达CSF-1的特征型肿瘤类型，在单独使用Emactuzumab单抗或联用时均可减少实体瘤患者体内M2-TAMs的数量(NCT01494688)[44]。另外，CSF-1R抑制剂(GW2580)的阻断作用可减少原肿瘤处M2-TAMs浸润，逆转晚期上皮性卵巢癌恶性腹水的血管渗漏[45],BLZ945也具有类似作用机制[43]。临床前研究结果显示BLZ945还对胶质母细胞瘤、乳腺癌和宫颈癌均有一定抗肿瘤作用，联合治疗晚期实体瘤也正在I临床研究中[42,43]。抗体阻断CSF-1信号方法如AMG 820和IMC-CS4治疗晚期实体瘤疗效正处于I期临床试验中，这些数据证实了CSF-1/CSF-1R抑制剂在协同免疫治疗效果的临床价值，同时暴露了药物在治疗的同时加速肿瘤耐药问题的出现。在胶质母细胞瘤小鼠模型中发现一种耐药机制，TME启动异型旁分泌，由T细胞或其他细胞分泌IL-4诱导IGF-1上调，激活神经胶质瘤细胞中ICF-1R和PI3K信号传导，从而促进肿瘤生长和恶化；抗PD-1抗性肝癌患者表达CSF-1转变巨细胞表型并驱动免疫逃逸、抗PD-1耐受性等耐药机制[46]。然而，这使得我们需要更好地了解临床上如何控制或阻止耐药性发生，提高疗效。

3.4双膦酸盐类

双膦酸盐是破骨细胞介导的骨吸收抑制剂，广泛用于绝经后骨质疏松、变形性骨炎以及恶性肿瘤骨转移等骨病的治疗。除此作用外，此类药物还可调节TAMs使其具备抗肿瘤活性[47]。双膦酸脂质体可通过减少TAMs的数量增强索菲拉尼对肝细胞癌异种移植模型中肿瘤血管生成、生长和转移的抑制作用[48]。另外在小鼠肺癌模型中显示其减少骨骼和肌肉中单核细胞转移的数量，并在小鼠肝癌模型中也得到了证实[49]。接受伊班膦酸盐或唑来膦酸治疗的癌症患者给药后，IFN-γ、TNF-α和IL-6的循环浓度均显著升高，进一步验证了氨基双膦酸盐可能通过促进M2型向M1型复极化以触发炎症反应。另外，非氨基双膦酸盐药物Clodronate则是通过抑制细胞而非细胞毒性的方式发挥作用，抑制巨噬细胞中iNOS mRNA表达，同时在非细胞毒性浓度下减少IL-6、IL-1β、TNF-α和NO的分泌[50]。尽管双膦酸盐已在各种临床前动物模型中提高了存活率，但单药治疗结果并不理想。事实上，双膦酸盐可能干扰正常组织中的巨噬细胞，从而影响抗肿瘤先天免疫。

3.5 Trabectedin

Trabectedin是一种从加勒比海被囊动物红树海蛸体内分离提取出来的烷化剂，与DNA小沟的特定序列共价结合，干扰转录耦合核苷酸切除修复系统中XPG蛋白正常功能，从而诱导DNA双链断裂。Trabectedin激活Caspase 8并诱导巨噬细胞凋亡，以减少肿瘤组织中TAMs数量，其中TRAIL-R2是仅存在于TAM上的死亡受体[51]。2015年获得欧盟委员会批准用于治疗卵巢癌和软组织肉瘤，在体外可选择性清除人单核细胞或巨噬细胞同时抑制CCL2和IL-6功能，为体内靶向TAMs的临床应用提供了证据[52]。在四种不同小鼠模型的临床前研究中，Trabectedin可选择性杀死血液、脾脏和肿瘤中的单核巨噬细胞，激活Caspase 8并在TRAIL-R2介导的凋亡途径中保护中性粒细胞和淋巴细胞，减少肿瘤区域募集和血管生成。软组织肉瘤患者治疗后活检结果也显示TAMs密度降低与血管生成减少相关，在实体瘤中也得到了相应的治疗效果[53]。目前有很多临床机制研究转化为临床试验，以评估其在多种人类癌症治疗中的安全性和有效性。

3.6 CD40激动剂

CD40是TNF受体超家族成员，由包括B细胞、树突细胞和巨噬细胞在内的抗原呈递细胞广泛表达，与其配体CD40L(主要由T细胞、嗜碱性粒细胞和肥大细胞表达)相互作用，上调MHC分子表达和IL-1、IL-12、TNF-α、MIP1α和NO等促炎性细胞因子释放，促进T细胞的活化[54]。现如今有三种广泛测试抗CD40抗体包括CP-870893、Dacetuzumab以及ChiLob7/4。强激动剂CP-870893是一种CD40人源化免疫球蛋白G2(humanized immunoglobulin G2,IgG2)单克隆抗体(monoclonal antibody, mAb),有证据显示CD40在不参与任何免疫效应通路的情况下能促进肿瘤细胞凋亡，联合化疗治疗实体瘤患者如胰腺癌、间皮瘤和黑色素瘤的协同作用已在临床中得到验证[55]。Dacetuzumab是一种比CP-870893弱的CD40激动剂IgG1 mAb,通过发出生长抑制信号诱导细胞凋亡，对正常细胞无明显影响。此外，已证实在体外介导B细胞淋巴瘤细胞系抗体依赖性细胞毒性，并增加B细胞淋巴瘤小鼠异种移植模型的存活率[56]。相比于CP-870893,其更易诱导细胞毒性作用来对抗肿瘤细胞如B细胞恶性肿瘤、部分黑色素瘤等。第三类激动剂为ChiLob7/4,其作用最弱，是一种CD40嵌合IgG1 mAb,诱导炎性细胞因子分泌，并在表达CD40的实体瘤和耐药性弥漫性大B细胞淋巴瘤I期临床研究中取得了较好的结果[57,58]。

3.7 SIRPα-CD47

巨噬细胞和树突细胞等吞噬细胞表面表达信号调节蛋白-α(signal regulatory proteinα,SIRPα)与肿瘤细胞表面的CD47相互作用，发出“不要吃我”的信号，抑制吞噬行为，对体内稳态具有重要意义[59]。在各类癌症模型临床前实验中，拮抗CD47可恢复巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和杀伤能力，产生有效的抗肿瘤免疫反应[60]。有研究者将抗SIRPα抗体与CSF-1R抑制剂组合成一个独特的超分子系统，实现TAM复极化[61]。除了抗CD47抗体外，对CD47具有高亲和力的SIRPα类似物被相继开发，如药物TTI-621的IgG1 Fc区与巨噬细胞上的Fcγ受体结合并激活，协同增强巨噬细胞的吞噬作用[62],由于SIRPα仅在髓系细胞(如巨噬细胞、单核细胞、粒细胞等)和神经元细胞表面表达，故研发了抗SIRPα药物KWAR23,但是双特异性抗SIPRα/CD70抗体更有效[63]。尽管关于抗SIRPα疗法相关研究不如抗CD47疗法多，但现有数据表明其特异性和副作用较少，使其成为阻断CD47-SIRPα通路中有前景的方法之一。由于临床前研究取得了不错的效果，针对CD47-SIRPα信号的相关变体如Hu5F9-G4[64]、CC-90002(抗CD47抗体)[65]、ALX148(高亲和力SIRPα变体)[66]和TTI-621(SIRPα-Fc融合)[67]也正处于研究阶段。其他“不吃我”信号如CD24,可与TAM表达Siglec-10结合保护癌细胞免遭巨噬细胞“攻击”[68],另外一个关键信号是MHCI结合蛋白家族如LILRB1,无特异性，易造成全身毒性[69]。总之，通过激活TAM吞噬能力是一种潜在肿瘤治疗方式。

3.8外泌体靶向递送

外泌体作为一种新型载药载体，已被用于药物递送的天然纳米级囊泡，具有优异的生物相容性、靶向性和低免疫原性等特点。与细胞膜相似结构，可穿透生物膜如血脑屏障，到达受体细胞后，通过生物膜融合(包括内吞作用、胞饮作用和吞噬作用)将囊内容物分泌到受体细胞中作用于相应信号通路[70]。鉴于巨噬细胞可优先拦截外泌体的特点，则递送基因药物或细胞毒性药物可优先抑制TAMs,如装载miR-214可显著抑制胃肿瘤的生长；相比游离多柔比星，通过外泌体递送多柔比星可使肿瘤细胞死亡倍数增加10倍[71]。肿瘤细胞所分泌带有原细胞相关遗传信息的外泌体可作为肿瘤免疫治疗的手段，在胰腺癌细胞分泌的外泌体中含有miR-155和miR-125b可诱导巨噬细胞表型为M1型，同样，结肠癌分泌wt-p53和miR-125b转染的外泌体也可介导巨噬细胞向M1表型复极化[72,73]。此外，Codiak公司等人开发了反义核苷酸工程化外泌体(antisense nucleotide exosomes, exoASO),研究表明exoASO可优先被M2-TAMs摄取，降低STAT6和C/EBPβmRNA水平，其结果与M2-TAMs到M1-TAMs复极化行为一致，也证实了外泌体可作为调节TAMs生物学功能的药物递送系统，未来也需要克服更多地困难达到临床使用标准[74]。

3.9其他治疗策略

近些年来，TAMs重编程策略日新月异，相关研究成果众多。PI3Kγ可通过抑制NF-κB通路和激活C/EBPβ来控制免疫激活与抑制之间进行转换[75],PI3Kδ/γ抑制剂RP6530在霍奇金淋巴瘤异种移植模型中使TAMs复极化，抑制肿瘤血管生成并促进肿瘤消退。截至目前，更为火热的研究话题是嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor, CAR),它是一个单链可变片段抗体，可附着在肿瘤细胞特定蛋白质上，根据胞内结构域不同，CAR已经发展至第四代，在血液肿瘤中取得了较好的治疗效果，受到基因工程CAR-T的启发，开发了类似的CAR-M、CAR-NK等细胞疗法[76]。有研究者通过诱导全能干细胞衍生CAR-M(induced pluripotent stem cells derived CAR-macrophages, CAR-iMACs)解决了肿瘤免疫治疗率低问题，体内可增殖并维持抗肿瘤活性[77]。另外一种人类表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)的CAR-M,与HER-2结合后可增加MMPs的表达，降解肿瘤细胞外基质，而由CD147组成的细胞内区域可促进TME中T细胞浸润，并抑制小鼠乳腺癌肿瘤生长[78]。同时，Carisma Therapeutics公司采用靶向HER-2的CAR对巨噬细胞进行改造，其小鼠实验证实CAR-M对肿瘤的良好杀伤效果，并发现HER-2-CAR-M能够将M2-TAMs转化为M1-TAMs,增强抗肿瘤细胞毒性作用，这也展现了CAR-M能够在肿瘤内创造炎性微环境的优势[79]。前不久该公司启动了HER-2-CAR-M(CT0508)的I期临床试验。CAR-M作为一种新型抗肿瘤治疗策略，不仅可以控制M2-TAMs向M1-TAMs型转化，激活树突状细胞，增强吞噬作用，促进T细胞抗原呈递作用，有助于长期适应性免疫反应。CAR系列细胞治疗药物虽然存在如脱靶毒副作用、神经毒性和炎症因子风暴等难题，但也为抗肿瘤治疗指引了新方向。

4、总结与展望

巨噬细胞是免疫系统和肿瘤之间相互作用的重要媒介，在促肿瘤生长、肿瘤血管生成和TME稳态平衡中发挥重要作用。然而，M2-TAMs是肿瘤难治性和耐药性产生的关键，开发靶向TAMs抗肿瘤免疫治疗策略是当务之急。研究人员针对TAMs开展大量研究工作，临床前和临床试验结果表明，通过重新编程TAMs或基于TAMs特定功能以及巨噬细胞工程化改造等方式可有效抑制肿瘤发展，改善患者预后。免疫抑制剂和一些天然药物可抑制TAMs增殖；磷酸化合物和TLR激动剂可逆转M2-TAMs为M1-TAMs;工程化改造巨噬细胞逆转其表型，减弱免疫抑制作用，增强免疫刺激能力等，但仍然存在很多亟待解决的问题和限制。在不同类型细胞之间相互作用机制不同且复杂，我们可以考虑利用单细胞测序、质谱仪以及空间转录组学等现代科学技术探索TAMs功能多样性和异质性；临床试验时也应考虑TAMs靶向药物对巨噬细胞过度耗竭、脱靶和全身毒性等问题，评估临床使用剂量和治疗时间，设计个性化治疗方案以提高疗效降低不良反应。如今巨噬细胞特异性标记物仍然需要继续探索，为了更好区分TAMs类型，以供患者进行最为合适的肿瘤免疫治疗方法。其实研究者已经意识到组合疗法有望提高免疫治疗效果，将TAMs靶向治疗结合其他治疗方法，最大程度提高疗效使更多患者受益，是到达TME靶向治疗的下一个里程碑。

基金资助:浙江省自然科学基金(编号:LY21H270016);

文章来源:罗汝婳,廖秀军.基于肿瘤相关巨噬细胞的抗肿瘤免疫治疗策略[J].现代肿瘤医学,2023,31(23):4455-4462.