摘要:目的:探讨硫化氢对大鼠肝纤维化的影响及作用机制。方法:选取27只雄性大鼠,将其随机分为3组,分别是对照组,空白对照组,观察组,每组9只。对对照组的大鼠腹腔注射四氯化碳,诱导大鼠肝纤维化;对观察组大鼠腹腔实施40%四氯化碳的基础上,还要在其腹腔注射硫化氢钠,每天注射一次,注射八周后停止。在实验结束后,检测大鼠的肝功能和纤维化指标数值,观察肝组织病理学变化,应用RT-PCR和Western印迹法检测肝组织转化生长因子TGF-β1的表达。结果:与对照组相比较,观察组能降低血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转酶(AST)以及透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三星前胶原(PC)水平,升高白蛋白(ALB),改善肝功能等,大鼠整体的肝组织病理明显改善。结论:硫化氢对控制肝纤维化具有显著的效果,并且也能减少细胞外基质在肝脏中的沉积,也能对肝纤维化的进程达到延缓作用。
肝纤维化是由多种原因引起的慢性肝损害所致的疾病病理改变,主要表现为肝内细胞外间质大量地沉积,由于这些细胞外间质无法降解,最终影响肝脏的功能,这种慢性病将最终发展成为肝硬化。肝纤维化是肝硬化的必经阶段,但是,肝纤维化还有好转的可能,如果患者接收治疗或调理,就有可能,而病情发展成肝硬化,则不会有好转的机会[1]。在转化生长因子β1则是肝纤维化的主要细胞因子,能够激活肝星状细胞,它能够促使肝内细胞外间质的降解。而在实验中使用的硫化氢,他是一种气体信号分子,是继一氧化氮、一氧化碳之后的第三种。通过研究表明,硫化氢具有扩张血管、抑制血管平滑肌增殖、抗氧化等多种功效,具有很强的生物学效应。本次实验选取27只雄性大鼠,将其分为三个组,分别采用不同的方法,结果显示,观察组中的大鼠各种指标,如:AST、HA、LN等都有所提高,效果显著,其具体报告如下:
1、资料与方法
1.1 主要的实验试剂
转氨酶试剂盒出自上海荣盛生物制剂厂,透明质酸、层粘连蛋白、三型前胶原放射免疫检测试剂盒为上海海军医学院研究所产品,而TGF-β1主要从美国的Santa Cruze公司购买。在实验操作过程中要严格按照盒上的步骤操作。
1.2 准备实验的动物
准备27只健康的雄性大鼠,每只都有6周龄,每只体重大约为200到220克,是由山东省实验动物中心提供。
1.3 方法
首先,将27只大鼠随机分为对照组、观察组和空白对照组,每组只大鼠。空白对照组的大鼠进行腹腔注射石蜡油0.1mL/kg,对照组和观察组的大鼠在腹腔注射40%的四氯化氢后再注射石蜡油0.1mL/kg,每周注射两次,共注射8周,在试验期间,大鼠可以自由活动,饮水和摄取食物不受任何影响。
其次,对大鼠的肝纤维和肝功能进行检测。将参与实验的大鼠麻醉,然后摘除眼球取适量的血,将血的血清分离,最后采用放免法检测大鼠的透明质酸(HA)、层粘连蛋白(LN)、三星前胶原(PC)水平。在检测AST和白蛋白时要按照试剂盒的说明进行操作。
1.4 疗效的评定标准
实施肝脏病理学检测,取肝左叶同一部位,将10%甲醛固定,不同浓度的乙醇脱水后,用石蜡包起来,用Masson染色,在光镜下观察肝组织炎症以及纤维组织增生状况,更具每次观察的结果,将纤维化分为5个等级,0级是没有纤维化,1级纤维结缔组织仅限于汇管区扩大,在肝小叶方向倾斜发展,2级指纤维结缔组织侵占肝小叶2/3部位,3级则是纤维结缔组织已经侵入肝小叶中央,4级则为纤维结缔组织超过肝脏的一半,并在多处增生。
1.5 统计学方法
统计软件SPSS16.0统计分析,计数资料采取率(%)表示,计量资料采取平均值±标准差(x±s)表示,组间率对比采取x2/T检验,P<0.05,具统计差异。
2、结果
通过对三组大鼠采用不同的试验方法,观察硫化氢对肝功能的影响。结果显示,对照组与空白对照组相比较,对照组的血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)与天门冬氨酸氨基转酶(AST)明显升高,对照组的特征与观察组相比较,观察组大鼠的血清丙氨酸氨基转换酶(ALT)与天门冬氨酸氨基转酶(AST)都有所降低,组间差异比较具有统计学意义。具体如表1所示:
表1 硫化氢对肝纤维化大鼠肝功能的影响(x±s)
大鼠肝脏病理变化比较,肝组织采用Masson染色观察,观察结果显示,正常的空白对照组的大鼠的肝小叶比较完整,肝内部排列比较整齐,结构也比较完整,而对照组的大鼠肝小叶肝索排列比较散乱,肝小叶结构受到遭到破坏。变性坏死细胞比较多。而观察组大鼠的坏死细胞比较少,肝纤维化程度降低。从整体研究结果显示,空白对照组为0级,而对照组多为3级和4级,观察组大鼠多在2级和3级。对照组和观察组大鼠的肝纤维化程度都有所减轻。具体内容如表2所示:
表2 各组大鼠肝组织纤维化程度〔n=9〕
3、讨论
硫化氢是一种无机化合物,在正常情况下,硫化氢是一种没有颜色的酸性气体,它的气味与浓度成反比,属于酸性,低浓度的硫化氢有臭鸡蛋的味道,并且对人的眼睛、呼吸等都有影响[2]。近几年,通过实验研究发现,气体硫化氢的特征与氧化氮、氧化碳的特征相似,在四氯化碳对照组大鼠中,大鼠的肝星状细胞的酶活性减弱,硫化氢的生成比例也明显减少,阻力相应的增强[3]。大鼠肝硬化的后期,其纤维化形成过程中硫化氢的含量显著下降。
肝纤维化形成的过程,氧应激下硫化氢对HSC具有一定的保护作用,能够减缓肝纤维化的发展速度,并且也能促使硫化氢参与氧化应激反应中,同时,患者血浆中的硫化氢降低与肝功能有密切的关系,它能够降低肝硬化患者血液中的谷氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶的水平[4]。
对肝硬化患者而言,在其肝纤维化过程中,HSC活化是肝纤维发生的核心环节,而促使纤维合成的因子是TGF-β1,他与肝纤维化的关系密切,主要通过刺激细胞让细胞向损伤部位转移或者增殖,还有,在HSC中,能够自动分泌出TGF-β1物质,进一步刺激细胞,让肝硬化的速度加快。肝受损后释放的TGF-β1,成了HSC激活的的主要信号之一,其在活化的过程中将释放出对肝不利的物质,进一步导致肝硬化的形成。
在四氯化碳诱导大鼠肝纤维化模型的实验中,硫化氢能够阻止肝星状细胞的活化和放大,具有抗肝纤维化的作用。并且硫化氢还有扩张血管的作用,能够促使血管的血液流通。在肝纤维化治疗中具有医学价值。
参考文献:
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