胃癌是最常见的消化系统恶性肿瘤，在全球范围内其发病率和死亡率分别位居各种恶性肿瘤的第5位和第4位[1]。虽然胃癌的手术治疗和化疗在过去几年取得了较大的进展，但由于胃癌发病机制复杂，其发生进展的具体作用机制尚未明确，胃癌患者仍存在预后较差、5年生存率低等问题[2,3]。

近年研究发现，肿瘤组织中存在着少数具有干细胞性质的细胞群即肿瘤干细胞[4]，这类细胞具有自我更新、恶性增殖和多向分化潜能，对放化疗高度抵抗，是肿瘤发生、进展和恶化的关键因素，抑制其恶性生物学行为有助于改善患者预后[5,6,7]。

MicroRNAs(miRNAs)是一系列高度保守的非编码RNA，长度20-24个核苷酸，通过与靶基因mRNA的3’非转录区(3’untranslatedregion,3’-UTR)完全或不完全匹配结合，使mRNA降解或抑制其表达。研究表明，多种miRNA在胃癌中异常表达，能够调控胃癌的生长、复发和转移等过程，有些已成为胃癌诊断的标志物及胃癌治疗的新靶点[8,9,10]。近年研究显示，miRNA与肿瘤干细胞关系密切，关于miRNA与肿瘤间关系及对肿瘤干样特性的作用已成为肿瘤治疗研究的新热点。研究证实，miR-142-3p可以降低乳腺癌干细胞特性以及对放射性的抗性[11]。miR-205-5p过表达可以有效抑制胆囊癌细胞的增殖力和耐药性，同时促进胆囊癌干细胞的凋亡[12]。龚立刚等[13]发现miR-486-5p通过负调控FOXO1表达抑制结肠癌HCT116的干细胞特性。

miR-7在胃癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌以及非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中表达下调，主要发挥抑癌作用[14,15,16,17,18]。YE等[19]研究结果显示，胃癌中miR-7的缺失会促进p65介导的异常NF-κB活化，促进肿瘤的转移，并最终导致预后不良，提示miR-7可能作为胃癌新的预后生物学标志物。XIE等[20]应用microRNA芯片检测发现，相比较于正常胃部细胞，miR-7在低分化和中分化的人胃癌MGC-803、MKN-45和SGC-7901细胞系中均表现出明显下调，采用miR-7表达载体转染MGC-803细胞后，细胞的增殖、侵袭和迁移能力均明显减弱。近期研究证实，奥沙利铂可能通过上调miR-7促进SGC-7901细胞凋亡，并降低细胞的侵袭和迁移速度[21]。LIN等[22]研究证实，miR-7通过抑制Raf-1表达以抑制胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭和裸鼠成瘤能力。然而，目前有关miR-7与胃癌细胞干样特性关系的研究较少，机制尚不明确。该研究拟通过调节miR-7-5p的表达，从成球能力、软琼脂集落形成能力以及CD24+CD44+细胞亚群比例等3个方面观察其对胃癌细胞干样特性的影响，可望能够为探明miR-7抑制胃癌发生进展的潜在机制提供更多的实验依据。

1、材料和方法

1.1 设计

细胞学对比观察实验，两组样本比较采用独立样本t检验。

1.2 时间及地点

实验于2019年3月至2021年7月在辽宁中医药大学生物化学与分子生物学实验室完成。

1.3 材料

人胃癌SGC-7901细胞购于北京北纳创联生物技术研究院。DMEM培养基、DMEM/F12培养基、双抗及胰酶均购于美国Hyclone公司；胎牛血清购于以色列Bioind公司；miRNA提取试剂盒、miRNA反转录试剂盒、miRNART-qPCR试剂盒购于南京Vazyme公司；RT-qPCR试剂盒购于美国Bimake公司；细胞培养瓶和培养板购于美国Corning公司；jetPRIME4转染试剂购于法国Polyplus公司；TRIzol、B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子以及CD24-PE和CD44-APC单克隆抗体均购于美国Invitrogen公司；低熔点琼脂糖购于美国Solarbio公司；miRNA抑制剂和模拟物由上海吉玛制药有限公司设计合成。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养

人胃癌SGC7901细胞复苏后培养于含1%青霉素-链霉素溶液和体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、体积分数为5%CO2的恒温培养箱中孵育，待瓶壁铺满80%时进行传代，细胞复苏后传到第3代开始使用。

1.4.2 转染及转染效率检测

实验分为NC、miR-7-5pmimics、inhibitorNC及miR-7-5pinhibitor组，具体序列见表1。

取生长状态良好的SGC-7901细胞接种到6孔细胞培养板中，(4.0-5.0)×105个/孔，培养24h后更换为新鲜无抗DMEM培养基，并按照说明书配制各组转染试剂，轻轻混匀后涡旋10s，室温静置10min，加入6孔板中继续培养(荧光标记miR-7-5pmimics所有实验操作需要避光)，转染4h后更换为新的无抗DMEM培养基培养，于倒置荧光显微镜下观察大致转染效率并拍照。

1.4.3 RT-qPCR检测miR-7-5p、Nanog和Sox2mRNA表达水平

转染48h后收集细胞，采用TRizol法提取各样本的总RNA，采用MipurecellmiRNA试剂盒提取miRNA,ND5000测定各组RNA浓度。取2μgRNA采用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-qPCR扩增，引物序列见表2。

miR-7-5p扩增反应条件为95℃5min预变性，95℃10s,56℃30s,72℃30s，共40个循环，以U6为内参。Nanog/Sox2反应条件为95℃5min预变性，95℃15s,60℃1min，共40个循环，以β-actin为内参。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，实验重复3次。

1.4.4 成球实验

转染处理48h后，胰酶消化各组细胞，用无血清DMEM/F12培养基[B27(1∶50),0.4%BSA]吹打，调整细胞浓度为1×106L-1。24孔超低吸附培养板中每孔加入1mL细胞悬液，每组设立3个复孔，每孔1mL无血清细胞悬液中所含因子及浓度为：20μg/L碱性成纤维细胞生长因子、20μg/L表皮细胞生长因子及10mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸。常规放入培养箱培养，7d后显微镜下观察细胞球形成情况并拍照。在显微镜下计数直径大于75μm的细胞球总数，实验重复3次。

1.4.5 软琼脂集落形成实验

转染处理48h后，准备2×DMEM培养液与0.6%低熔点琼脂糖溶液按1∶1混合配置上层0.3%软琼脂凝胶，同时各组取3×103个细胞与之充分混匀后注入下层已预加0.5%软琼脂凝胶的6孔板中，常规放入培养箱培养，7d后显微镜下观察集落形成情况并拍照。在显微镜下计数直径大于50μm的集落总数，实验重复3次。

1.4.6流式细胞术检测CD24+CD44+细胞亚群比例

转染48h后，采用不含EDTA的胰酶消化各组细胞，PBS轻洗细胞1次，加入100μLPBS重悬细胞，再向细胞悬液中加入推荐量直接偶联的一抗，混匀后4℃避光孵育30min，然后PBS轻洗细胞2次，过300目筛尼龙网，送检分析，实验重复3次。

1.5 主要观察指标

各组细胞成球力、软琼脂集落形成能力、CD24+CD44+细胞亚群比例以及Nanog和Sox2mRNA表达水平。

1.6 统计学分析

应用SPSS19.0软件对数据进行统计学分析，计量数据以表示，两组样本比较采用独立样本t检验，P<0.05为差异有显著性意义。

2、结果

2.1 转染miR-7-5pmimics/inhibitor对人胃癌SGC-7901细胞中miR-7-5p表达水平的影响

为探讨miR-7-5p对胃癌细胞干样特性的影响，该研究首先通过转染miR-7-5pmimics/inhibitor过表达或抑制人胃癌SGC-7901细胞中的miR-7-5p。转染4h后，通过倒置荧光显微镜观察SGC-7901细胞内的荧光情况，发现绝大部分细胞内都能看到绿色荧光，见图1A，提示细胞转染成功。转染48h后，RT-qPCR检测结果显示，与NC组比较，miR-7-5pmimics组细胞中miR-7-5p表达水平显著上调(P<0.01)，见图1B；而与inhibitorNC组相比，miR-7-5pinhibitor组细胞中miR-7-5p表达水平则明显下调(P<0.01)，见图1C。结果提示，miR-7-5pmimics/inhibitor能够有效增加或抑制miR-7-5p的表达。

2.2 miR-7-5p对人胃癌SGC-7901细胞成球能力的影响

转染48h后，miR-7-5pmimics组细胞成球数显著低于NC组[(44.67±5.51)个vs.(25.00±4.58)个，P<0.05]，见图2A,B;miR-7-5pinhibitor组成球数显著高于inhibitorNC组[(39.00±6.08)个vs.(52.00±2.00)个，P<0.05]，见图2C,D。结果提示，miR-7-5p可以有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的成球能力。

2.3 miR-7-5p对人胃癌SGC-7901细胞软琼脂集落形成能力的影响

与NC组相比，miR-7-5pmimics组集落形成数量明显减少[(57.00±8.19)个vs.(17.67±7.23)个，P<0.01]，见图3A,B。与inhibitorNC组相比，miR-7-5pinhibitor组集落形成数量明显增加[(56.00±5.29)个vs.(98.33±9.87)个，P<0.01]，见图3C,D。结果提示，miR-7-5p可以有效抑制人胃癌SGC-7901细胞的软琼脂集落形成能力。

2.4 miR-7-5p对人胃癌SGC-7901细胞中CD24+CD44+细胞比例的影响

流式细胞术结果显示，miR-7-5pmimics组CD24+CD44+细胞比例明显低于NC组[(59.67±5.38)%vs.(32.57±2.21)%,P<0.01]，见图4A,B，且在miR-7-5pinhibitor组中CD24+CD44+细胞的比例显著高于inhibitorNC组[(63.50±2.16)%vs.(70.46±1.29)%,P<0.01]，见图4C,D。结果提示，miR-7-5p可以有效抑制人胃癌SGC-7901细胞中CD24+CD44+细胞比例。

2.5 miR-7-5p对人胃癌SGC-7901细胞中Nanog和Sox2mRNA表达的影响

RT-qPCR结果显示，miR-7-5pmimics组Nanog和Sox2表达明显低于NC组(P<0.05,P<0.01)，见图5A,miR-7-5pinhibitor组Nanog和Sox2表达显著高于inhibitorNC组(P<0.05,P<0.01)，见图5B，结果提示miR-7-5p能够有效抑制干样特性相关基因Nanog和Sox2mRNA在胃癌SGC-7901细胞中的表达。

3、讨论

1994年最早有研究报道在急性白血病中发现肿瘤干细胞，目前在脑、肝、乳腺、胃肠道等多个部位已有肿瘤干细胞的研究报道[23]。胃癌干细胞的研究起步于2009年，TAKASSI等[24]用加入生长因子的无血清培养基培养分选出表达CD44+的胃癌细胞，数周后胃癌细胞成球状生长，将少量球状生长的胃癌细胞接种至NOD/SCID小鼠胃黏膜下和皮下即可成瘤。肿瘤干细胞与组织干细胞类似，具备自我更新、分化和抗凋亡等特征，是启动和维持肿瘤转移的关键因素，探索影响肿瘤干样特性的潜在机制具有重要意义。

miRNAs与肿瘤等人类疾病关系密切，miRNA异常表达可以促进肿瘤的发生和发展[25,26,27]。miR-7-5p作为抑制肿瘤的miRNA被广泛报道，能够影响多种肿瘤生存、增殖、侵袭和转移并增加耐药肿瘤细胞的敏感性[28,29]。现有研究发现，miR-7通过CD42影响神经干细胞的迁移和增殖，从而抑制周围神经损伤修复[30]。miR-7-5p可能通过KLF4/PI3K/Akt/p21通路抑制前列腺癌的干样特性，能够抑制耐药胶质母细胞瘤细胞的干性并提高替莫唑胺的敏感性[31,32]。PAN等[33]研究发现，miR-7通过影响ALDH1A3活性减少乳腺癌干细胞亚群分布进而抑制乳腺癌生长。上述研究提示，miR-7-5p很可能参与调节肿瘤干细胞的生物学功能。

成球和软琼脂集落形成实验是证实肿瘤细胞干样特性的主要体外研究方法，用于证实肿瘤细胞的自我更新能力。该研究结果显示，miR-7-5p过表达能够降低胃癌细胞成球和软琼脂集落形成能力，抑制miR-7-5p则发挥相反的作用。结果提示，miR-7-5p能够抑制胃癌细胞的自我更新能力，影响胃癌细胞的干样特性。

目前胃癌干细胞表面标志物比较公认的有CD44、CD24、CD326、CD133等[34]，其单独或者联合使用可用于分选胃癌干细胞。CD44是最早被确定的胃癌干细胞的表面标志分子，在胃癌组织及细胞中表达上调，参与调控胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、化疗抵抗等多种生物学功能[35,36,37]。CD24是一种高度糖基化的细胞表面蛋白，在干细胞中表达，并在各种人类恶性肿瘤中过表达，是多种肿瘤干细胞的表面标志分子[38,39,40,41]。CD24高表达与胃癌淋巴结转移、静脉浸润和淋巴浸润显著相关，其高表达是判断胃癌预后的一个潜在生物标志物[42]。DENG等[43]研究发现，与人正常胃癌上皮GES1细胞相比较，CD24在人胃癌SGC-7901和BGC-823细胞中显著高表达，并且对细胞的迁移力有明显的促进作用。FENG等[44]研究显示，泮多拉唑处理能够有效降低人胃癌SGC-7901和HGC-27细胞的增殖力、化疗敏感性以及干细胞表面标志分子的表达量(CD44、CD24、ABCG2和EpCAM)。ZHANG等[45]研究发现，在人胃癌AGS细胞系中CD44+CD24+细胞亚群具干细胞特性。上述研究提示，CD44+和CD24+是潜在的胃癌干细胞表面标志物，能够反映肿瘤细胞中具有干细胞特性的肿瘤细胞比例，预示着细胞的恶性生物学潜能。该研究结果显示，miR-7-5p过表达后，SGC-7901细胞中CD44+CD24+细胞比例显著降低，抑制其表达后CD44+CD24+细胞比例明显升高。结果提示，miR-7-5p能够有效抑制CD44+CD24+细胞亚群比例，影响胃癌细胞的干样特性。

Nanog和Sox2都是具有转录调节作用的转录因子，主要在干细胞的自我更新、增殖、分化等功能调节中起重要作用。研究发现，Sox2、Nanog及Oct4在胃癌中显著过表达，是影响胃癌进展和预后的潜在生物标志物[46]。MALAT1通过增强Sox2mRNA的稳定性促进胃癌干细胞球对放化疗的抵抗作用[47]。ID1通过上调Nanog和Sox2的表达以促进胃癌细胞(MGC803和MKN28)的成球能力、软琼脂集落形成能力、增殖力以及对顺铂的耐药性[48]。该研究结果显示，miR-7-5p过表达可以降低Nanog和Sox2的表达，抑制miR-7-5p表达后Nanog和Sox2表达升高，提示miR-7-5p能够调节胃癌细胞干性相关基因Nanog和Sox2表达，这可能是其影响胃癌细胞成球和集落形成能力、调节CD44+CD24+细胞亚群比例的潜在作用机制之一。

综上所述，该研究提示miR-7-5p可以抑制胃癌细胞干样特性，这可能是其抑制肿瘤侵袭转移的机制之一。

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文章来源：郭隽馥,李乡南,马天驰,苗兰英.miR-7-5p对人胃癌SGC-7901细胞干样特性的影响[J].中国组织工程研究,2022,26(19):3174-3179.