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miR-26a靶向IGF-1抑制子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭

2021-11-10 205 上传者：管理员

摘要：目的探讨miR-26a靶向胰岛素样生长因子1基因(IGF-1)对子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法将原代培养的子宫肌瘤细胞分为miR-NC组(转染mimics阴性对照序列)、miR-26a组(转染miR-26a模拟物mimics)、(miR-26a+pcDNA3.1)组(共转染miR-26amimics及空载体)和(miR-26a+IGF-1)组(共转染miR-26amimics及IGF-1过表达载体)。RT-qPCR检测miR-26a表达;MTT法及Transwell小室法分别检测细胞增殖和迁移和侵袭;Westernblot检测细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-26a和IGF-1靶向关系。结果miR-26a组子宫肌瘤细胞miR-26a表达明显升高(P<0.05)。与miR-NC组比较,miR-26a组细胞增殖、迁移和侵袭能力明显降低,PCNA和MMP-2表达明显降低,而E-cadherin表达明显升高(P<0.05)。miR-26a和IGF-1存在靶向关系。过表达IGF-1可减弱miR-26a对子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低作用,减弱对PCNA和MMP-2表达的抑制作用(P<0.05),减弱对E-cadherin表达促进作用(P<0.05)。结论过表达miR-26a可通过靶向IGF-1抑制子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭。

关键词：
miR-26a
分子机制
子宫肌瘤
胰岛素样生长因子1
迁移和侵袭
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子宫肌瘤(uterineleiomyoma)是常见的妇女生殖系统肿瘤，近些年该病的发病率逐年升高，是引起子宫切除的一个主要原因[1]。子宫肌瘤细胞受到刺激后的异常增殖、迁移和侵袭是其发生发展的主要原因[2],因此，探究影响子宫肌瘤细胞增殖的分子机制具有重要意义。越来越多的研究表明，微小RNA(microRNA,miRNA)在多种肿瘤发生发展中有重要作用，其异常表达与疾病进展有关[3,4]。miR-26a是miRNAs成员之一，子宫肌瘤组织中miR-26a表达下调，其高表达miR-26a可抑制肌瘤细胞增殖能力，阻滞细胞周期[5]。胰岛素样生长因子1(insulinlikegrowthfactor1,IGF-1)的结构与胰岛素相似，对细胞增殖、分化等有重要作用，与肿瘤发生密切相关[6]。IGF-1在子宫肌瘤组织中过度表达，提示IGF-1可能影响子宫肌瘤细胞增殖[7]。miR-26a是否可调控IGF-1影响子宫肌瘤细胞增殖尚未明确。因此，本研究旨在分析miR-26a靶向IGF-1对子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并进一步研究其作用机制。

1、材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本的采集：

随机选择2018年9月至2019年6月在成都市第三人民医院妇产科因子宫肌瘤住院且行子宫切除术或肌瘤剔除术的患者6例，所有患者月经规律，且无内外科合并症，年龄38～48岁，平均年龄为(42.8±2.7)岁。所有的患者在术前3个月均无激素类药物治疗史，且术后经病理证实为子宫肌瘤。所有采集的样本均经过患者的同意，并签订知情同意书。获得成都市第三人民医院伦理委员会批准(伦理批号：20180712)。

1.1.2 主要试剂：

胎牛血清、DMEM培养基(Gibco公司);RNA试剂盒、脂质体LipofectamineTM2000(Invitrogen公司);PCR试剂盒、反转录试剂盒(美国ABI);miR-26a模拟物(mimics)及模拟阴性序列(miR-NC)、miR-26a抑制物(anti-miR-26a)及阴性序列(anti-miR-NC)、IGF-1过表达载体(pcDNA3.1-IGF-1)及空载体(pcDNA3.1)均由上海生工合成；MTT、DMSO(Sigma-Aldrieh公司);Transwell小室(Corning公司);荧光素酶活性检测试剂盒(Promega公司);IGF-1、增殖细胞核抗原(PCNA)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和基质金属蛋白酶2(MMP-2)抗体(Abcam公司)。

1.2 方法

1.2.1 人子宫平滑肌瘤细胞(leiomyomacell)的分离培养：

用眼科剪将每块标本剪成约1cm×1cm×1cm大小，用巴氏滴管转移DMEM及组织至离心管中，1000r/min离心5min,离心后将上清去除。加入Ⅰ型胶原酶，封口以防止污染，37℃恒温水浴摇床中消化，每间隔1h使用300目不锈钢细胞滤网过滤1次，约消化3～5h后终止消化，1000r/min离心5min,去上清。台盼蓝拒染试验检测细胞的成活率。适量DMEM培养液(含10%胎牛血清)悬浮沉淀，于37℃、饱和湿度、5%体积分数CO2培养箱中培养。贴壁过夜后，更换培养液，此后每3d换液1次。显微镜下观察到培养瓶壁上细胞铺满80%～90%时，即可进行传代。取增殖至对数期的细胞用于实验研究。

1.2.2 细胞的分组和处理：

转染前1d,将对数期的子宫肌瘤细胞接种于6孔板中，2×105个/孔，细胞达70%汇合度后进行转染。转染参照说明进行操作。将LipofectamineTM2000与待转染物混匀，制备成复合物，将复合物加入6孔板相应孔内，于37℃、5%体积分数CO2培养箱孵育6h,更换含有血清的培养基，继续培养细胞48h,用于后续实验研究。细胞分为miR-26a组(转染miR-26amimics)、miR-NC组(转染miR-NC)、anti-miR-26a组(转染anti-miR-26a)、anti-miR-NC组(转染anti-miR-NC)、(pcDNA3.1-IGF-1)组(转染pcDNA3.1-IGF-1)、(miR-26a+IGF-1)组(转染miR-26amimics+pcDNA3.1-IGF-1)、对照组(未转染细胞)。

1.2.3 RT-qPCR检测miR-26a表达：

用总RNA试剂盒提取细胞总RNA,紫外分光光度计检测RNA浓度及质量后，依照反转录试剂盒说明反转录为cDNA。依照qPCR试剂盒说明配置反应体系，体系为20μL,反应条件为50℃2min,95℃10min;95℃15s,60℃1min,共40个循环。反应结束后，以U6作为内参基因，用公式2-△△Ct计算miR-26amRNA相对表达量。每个样本设置5个复孔，实验重复3次。

1.2.4 MTT比色法检测细胞活力：

接种子宫肌瘤细胞于96孔板，接种为5×104/mL,100μL/孔，于37℃、饱和湿度、5%体积分数CO2培养箱中孵育，观察到细胞完全贴壁后，分别在转染的24、48和72h,在每孔中加20μLMTT液(5mg/L),于培养箱内孵育4h,弃掉上清，PBS洗涤细胞，然后在每孔中加DMSO150μL,置于摇床上低速震荡10min溶解形成的结晶，在490nm波长下，采用酶标仪检测吸光度(A)值，实验重复3次。

1.2.5 Transwell小室法检测细胞迁移及侵袭能力：

在Transwell小室检测细胞侵袭实验前，预先在小室上层铺30μL基质胶。小室上室接种按照上述操作转染48h的细胞(约5×104个),下室装培养基(含10%胎牛血清),于培养箱内孵育24h,甲醇固定，结晶紫染色，棉签轻轻擦除上室内贴附于滤膜上的细胞，显微镜下随机选择5个区域进行细胞计数。取均值，实验重复3次。细胞迁移能力检测除了未铺基质胶外，其他操作与检测细胞侵袭步骤一致。实验重复3次。

1.2.6 荧光素酶报告基因实验验证miR-26a与IGF-1靶向关系：

通过靶基因预测软件发现miR-26a与IGF-1的3′UTR有可结合的位点，构建IGF-1的3′UTR双荧光报告质粒，即IGF-1野生型(IGF-1-WT)和IGF-1突变型(IGF-1-MUT)质粒，并与miR-26a共转染至子宫肌瘤细胞，参照荧光素酶活性检测试剂盒说明书，按照步骤检测子宫肌瘤细胞荧光素酶活性，从而验证miR-26a与IGF-1的靶向关系。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海参荧光素酶活性值。实验重复3次。

1.2.7 Westernblot检测蛋白表达：

提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。按照20～30μg/孔上样，经SDS-PAGE分离蛋白，转PVDF膜，5%的脱脂奶粉封闭膜，膜封闭2h,加一抗(1∶500稀释的IGF-1、PCNA、E-cadherin、MMP-2抗体),4℃孵育过夜，洗膜，加二抗，37℃摇床震荡封闭1h。ECL显色，Bio-Rad曝光仪曝光，QuantityOne软件定量蛋白。实验重复3次。

1.3 统计学分析

所有实验数据采用SPSS21.0软件进行分析，计量资料用均数±标准差(x¯±s)表示，多组差异比较采用单因素方差分析，两两比较采SNK-q检验。

2、结果

2.1 miR-26a过表达转染效率

miR-26a组miR-26a表达(7.462±0.553)明显高于对照组(1.000±0.100)(P<0.05)。

2.2 miR-26a对子宫肌瘤细胞增殖的影响

miR-26a组细胞在24～72h的细胞增殖均明显低于空白组(P<0.05)(表1)。

2.3 miR-26a对子宫肌瘤细胞迁移和侵袭的影响

miR-26a组和空白组比较，细胞迁移和侵袭能力均明显降低(P<0.05)(表2)。

2.4 靶基因预测

靶基因预测软件发现miR-26a和IGF-1的3′UTR存在结合位点(图1A)。miR-26amimics可明显降低IGF-1-WT的荧光素酶活性(P<0.05)(表3)。miR-26a组IGF-1表达明显低于miR-NC组，而anti-miR-26a组IGF-1表达明显高于anti-miR-NC组(P<0.05)(图1B,表4)。

2.5 过表达IGF-1可以缓解过表达miR-26a对子宫肌瘤细胞增殖、迁移及侵袭影响

与(miR-26a+pcDNA3.1)组比较，(miR-26a+IGF-1)组细胞增殖、迁移及侵袭能力均明显升高(P<0.05)(表5)。

2.6 过表达IGF-1可缓解miR-26a对子宫肌瘤细胞PCNA、E-cadherin、MMP-2表达的影响

与miR-NC组比较，miR-26a组PCNA和MMP-2表达明显降低，E-cadherin表达明显升高(P<0.05);与(miR-26a+pcDNA3.1)组比较，(miR-26a+IGF-1)组PCNA和MMP-2表达明显升高，E-cadherin表达明显降低(P<0.05)(图2,表6)。

3、讨论

miR-26a是miRNAs大家族一员，对食管癌、甲状腺癌等多种肿瘤生长有抑制作用[8,9]。但目前miR-26a对子宫肌瘤细胞生物学行为的影响较少。前人研究表明，miR-26a高表达可抑制子宫肌瘤细胞增殖[5],本研究中，将miR-26a模拟物转染子宫肌瘤细胞，细胞中miR-26a表达明显升高，提示构建的miR-26a过表达载体成功，进一步的细胞生物学特性研究显示，过表达miR-26a可明显抑制子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭，提示miR-26a对子宫肌瘤细胞的恶性增殖、迁移和侵袭行为具有抑制作用。

IGF-1由肝脏分泌，是一种多功能的细胞调控因子，对机体生长发育有促进作用。有研究发现，在子宫肌瘤组织中IGF-1高表达，雌激素可促进IGF-1对细胞增殖促进作用[10]。体外研究发现，性激素缺乏时IGF-1对细胞有丝分裂也有促进作用，促进细胞增殖，进而引起子宫肌瘤的发生发展[11]。有研究显示，miR-26a可通过靶向IGF-1抑制骨肉瘤细胞增殖[12]。本研究通过双荧光素酶实验证实miR-26a和IGF-1存在靶向关系。进一步的研究发现，过表达IGF-1可减弱miR-26a对子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用。提示miR-26a可靶向IGF-1影响子宫肌瘤细胞恶性增殖、迁移和侵袭行为。

PCNA是一种DNA聚合酶的辅酶，可直接参与DNA合成，与细胞增殖存在密切关系，其含量可反映出细胞增殖活性[13]。上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)对肿瘤侵袭转移起到关键作用，E-cadherin是钙黏附蛋白家族成员之一，其表达缺失或减少可促进细胞的迁移及侵袭[14]。MMPs是细胞外重要的基质降解酶，在肿瘤迁移和侵袭中发挥重要作用，MMP-2是MMPs中重要的一种，有研究显示，下调MMP-2可抑制子宫肌瘤细胞迁移和侵袭[15]。本研究结果显示，过表达miR-26a可抑制PCNA和MMP-2表达，促进E-cadherin表达，而过表达IGF-1可减弱miR-26a对PCNA和MMP-2表达抑制及E-cadherin表达促进作用。提示miR-26a可靶向IGF-1影响子宫肌瘤细胞PCNA、MMP-2和E-cadherin表达。

综上所述，在子宫肌瘤细胞过表达miR-26a可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，作用机制可能与调控IGF-1表达有关，对子宫肌瘤细胞增殖、迁移和侵袭影响可能与调节PCNA、MMP-2和E-cadherin表达有关。miR-26a/IGF-1可能为子宫肌瘤治疗提供了潜在的靶点。

参考文献:

[2]韩永贵,孙长冬.子宫肌瘤组织中肌球蛋白轻链激酶和硫酸基转移酶2A1表达量与细胞侵袭､上皮间质转化的相关性[J].中国妇幼保健,2018,33535-3538

[5]杨璐西,翟东霞,张丹英,等.mir-26a对子宫肌瘤细胞周期和增殖的影响[J].现代生物医学进展,2016,16.4224-4227.

[7]纪巍,辛晓燕,陈必良.IGF-1及其受体在子宫平滑肌瘤中的表达以及与雌､孕激素关系[J].临床军医杂志,2009,37:127-129.

文章来源：向雪芹,崔权哲,童玉娜,詹文斌,陆静.miR-26a靶向IGF-1抑制子宫肌瘤细胞增殖､迁移和侵袭[J].基础医学与临床,2021,41(11):1612-1617.