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柴朴汤对肝郁型哮喘小鼠CADM1、MAL、IL-33、TSLP表达的影响

2021-09-08 76 上传者：管理员

摘要：：目的探讨柴朴汤对肝郁型哮喘小鼠细胞黏附分子1(CADM1)、T细胞成熟相关蛋白(MAL)、白细胞介素-33(IL-33)、胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)表达的影响。方法将18只Balb/c小鼠随机均分为正常组、肝郁型哮喘组、柴朴汤组。按照文献复制肝郁型哮喘模型,使用柴朴汤干预。采用免疫印迹法检测小鼠肺组织中CADM1、MAL、IL-33、TSLP的蛋白表达量,定量反转录聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测各组CADM1、MAL、IL-33、TSLP的信使核糖核酸(mRNA)表达情况。结果肝郁型哮喘组CADM1、MAL蛋白及mRNA表达量均低于正常组(P<0.05)和柴朴汤组(P<0.05)。肝郁型哮喘组IL-33、TSLP蛋白及mRNA表达量均高于正常组(P<0.05)和柴朴汤组(P<0.05)。结论柴朴汤能上调肝郁型哮喘小鼠CADM1、MAL的表达,且下调IL-33、TSLP的表达。

关键词：
T细胞成熟相关蛋白
柴朴汤
白细胞介素-33
细胞黏附分子1
肝郁型哮喘
胸腺基质淋巴细胞生成素
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支气管哮喘发病的关键环节为气道上皮细胞的损伤及修复不足。细胞黏附分子1(celladhesionmolecules,CADM1)是免疫球蛋白超家族中有细胞间连接功能的一种蛋白质[1]。CADM1在支气管上皮细胞、肺上皮细胞中均有表达，并且能介导细胞之间的黏附[2,3]。在维持上皮细胞完整性过程中，CADM1起着不可忽视的作用。Zhang等[4]研究发现，跨细胞的CADM1相互运动可驱动突触融合蛋白1向包膜的聚集，介导囊泡的形成，表明CADM1在胞内外的转运由囊泡介导，而T细胞成熟相关蛋白(T-lymphocytematurationassociatedprotein,MAL)可参与囊泡转运[5],从而有助于维持上皮细胞极性。气道上皮细胞在各种损伤因素作用下，可释放白细胞介素-33(recombinantinterleukin33,IL-33)、胸腺基质淋巴细胞生成素(thymicstromallymphopoietin,TSLP),这些细胞因子能够作用于辅助性T细胞2(T-helperlymphocytetype2,Th2)和固有淋巴样2型细胞，其通过释放Th2细胞因子，参与哮喘的发生、发展[6]。前期研究表明，MAL在哮喘中呈下调趋势，而柴朴汤能够上调MAL的表达来减轻哮喘的炎症反应[7]。本文探讨柴朴汤治疗肝郁哮喘小鼠的作用机制。

1、材料和方法

1.1材料与仪器

健康雌性Balb/c小鼠(湖南天勤生物科技有限公司);卵清白蛋白(美国Sigma公司);氢氧化铝凝胶(Thermo公司);柴朴汤中药配方颗粒(广东一方制药有限公司);CADM1-抗体和MAL-抗体(美国Proteintech公司)。mRNA反转录试剂盒(北京康为世纪公司);雾化器(北京欧姆龙医疗器械有限公司);荧光定量RCP仪(美国Thermo公司);动物雾化箱(有机玻璃自制);电泳仪(北京六一公司);旋涡混合器(江苏其林贝尔公司);台式冷冻离心机(湖南湘仪公司)。

1.2肝郁型哮喘模型的建立

18只6周龄健康雌性Balb/c小鼠，体质量(20±2)g。将其随机分为正常组、肝郁型哮喘组、柴朴汤组，每组6只。小鼠适应性喂养1周，肝郁型哮喘组、柴朴汤组均按文献[8]建立肝郁型哮喘模型。将肝郁型哮喘组、柴朴汤组小鼠分别于第0天和第7天予以卵白蛋白(ovalbumin,OVA)10μg+Al(OH)3凝胶400μg+生理盐水0.2mL腹腔注射，正常组则予以生理盐水0.2mL腹腔注射。第21天肝郁型哮喘组、柴朴汤组置于密闭的有机小箱内，超声雾化机雾化1%OVA,每天1次，每次30min,连续雾化7天，柴朴汤组根据前期实验结果选择柴朴汤剂量[9],即每次雾化前半小时予以柴朴汤0.3mL(1.5g/kg)灌胃，正常组予以生理盐水0.3mL雾化。小鼠在第28天激发完成24h后，腹腔注射10%水合氯醛0.1mL,麻醉后腹主动脉放血处死。

1.3HE染色

4%甲醛将肺组织固定，常规石蜡包埋及切片，HE染色，显微镜下观察肺组织形态。

1.4Westernblot法检测CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白的表达

按照试剂盒说明书操作：配胶，制胶，跑胶，转膜，将一抗稀释至一定浓度，稀释HRP标记的二抗，二抗孵育后吸干水分，曝光、显影，用quantityone专业灰度分析软件进行分析，得出平均光密度(OD值)为其蛋白表达量。

1.5qRT-PCR法检测CADM1、MAL、IL-33、TSLPmRNA的表达

一步法提取肺组织总RNA,引物由上海生工合成。β-actin引物：上游：5′-ACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3′,下游：5′-TACTCCTGCTTGGATCCAC-3′,产物长度223bp。CADM1引物：上游：5′-ATGTGGAAAACCTACGCTGA-3′,下游5′-TCCTTTACAAACCAGTCCGTTC-3′,产物长度150bp。MAL引物：上游：5′-CCTTGCTGTTGCCCCTAGAACCC-3′,下游：5′-CCCCACTTTGACATCCATTCCCT-3′,产物长度147bp。IL-33引物：上游：5′-ATTCTGGCTTACGATGTTGT-3′,下游：5′-TCCTTCAGTTTCTTTACCAACGC-3′,产物长度126bp。TSLP引物：上游：5′-TGCCCTTCACTCCCCGACA-3′,下游：5′-TGTGCCATTTCCTGAGTACCG-3′,产物长度113bp。PCR扩增反应条件为预变性、变性、退火、延伸、循环，其中各因子反应条件如下：CADM1:95℃5min,95℃45s,60℃1min,72℃1min,35个循环；MAL:95℃10min,94℃5min,60℃45s,72℃1min,40个循环；IL-33:95℃30s,95℃5s,退火/延伸60℃20s,扩增40个循环。TSLP:95℃2min,95℃15s,60℃1min,60℃15s共40个循环。溶解曲线采集，60～95℃。

1.6统计学分析

运用SPSS24.0统计软件，实验数据均采用x¯±s;组间均数两两比较用t检验，采用单因素(One-WayANOVA)或者重复测量的方差分析法；P<0.05为差异显著性。

2、结果

2.1模型小鼠成功建立

造模小鼠出现易激、挣扎、慢性不可预见性刺激的持续，开始出现毛发无光泽，大便松散，活动度减少，躲避，对刺激反应减弱。在肝郁模型基础上，予以致敏原激发后，小鼠表现出点头呼吸、口唇发绀、腹肌收缩等表现，表明肝郁型哮喘模型建立成功。

2.2病理改变

正常组小鼠气道无炎性细胞浸润，同时，管壁未见明显增厚，管腔结构规则(图1A)。肝郁型哮喘组气管壁增厚明显，支气管内可见大量炎性细胞浸润，管腔不规则且变得狭窄，并可见大量黏液分泌现象(图1B)。柴朴汤组病理改变较肝郁型哮喘组明显减轻(图1C)。

2.3各组CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白表达的比较

肝郁型哮喘组CADM1、MAL蛋白相较正常组和柴朴汤组明显降低(P<0.05),IL-33、TSLP蛋白较正常组和柴朴汤组明显升高(P<0.05;图2)。

2.4各组CADM1、MAL、IL-33、TSLPmRNA表达的比较

肝郁型哮喘组CADM1及MALmRNA较正常组和柴朴汤组明显降低(P<0.05),而IL-33、TSLPmRNA较正常组和柴朴汤组明显升高(P<0.05;图3)。

图1各组小鼠肺组织病理形态学改变(HE,400×)

A为正常组;B为肝郁型哮喘组;C为柴朴汤组。

图2各组小鼠肺组织CADM1、MAL、IL-33、TSLP蛋白表达量

A为westernblot实验结果;B为蛋白表达柱状图。a为P<0.05,与对照组比较;b为P<0.05,与肝郁型哮喘组比较。

图3各组小鼠肺组织中CADM1、MAL、IL-33、TSLPmRNA表达量

a为P<0.05,与正常组比较;b为P<0.05,与肝郁型哮喘组比较。

3、讨论

哮喘病机为气与血、津液与痰的异常，肺脾肾三脏受累，而肝与痰的生成、气之升降失常及瘀血的产生关系密切[10]。柴朴汤是由小柴胡及半夏厚朴汤组成，能疏肝清肺化痰，使气机升降自如，气血调畅而达到哮喘自平。柴朴汤通过上调MAL蛋白的表达从而抑制MAPK/ERK这一信号通路，下调支气管上皮细胞中的TLR4和NF-kB的mRNA及其蛋白的表达来减轻炎症反应[9,11]。

MAL蛋白是分离于T淋巴细胞分化中晚期的一种高度疏水性蛋白，主要在上皮细胞中发挥作用。肝郁证致肾上腺皮质激素释放过度，进而抑制免疫功能。免疫功能失衡易诱发哮喘，而气道上皮细胞在气道免疫中起着重要作用。肝郁型哮喘组小鼠肺组织MAL蛋白及mRNA的表达量明显低于正常组(P<0.05),表明MAL参与了肝郁型哮喘的发生。而使用柴朴汤灌胃后，MAL的表达量明显上调。

CADM1是表达于上皮细胞中的一种跨膜糖蛋白，它能通过与相邻细胞中表达的CADM1结合来介导细胞间的附着[12]。在以气道上皮损伤为特征的肺部疾病中，如间质性肺疾病、肺气肿等变应性疾病中CADM1明显下调[13]。气道上皮细胞的破坏能诱发气道炎症及重塑。本文肝郁型哮喘组小鼠CADM1表达明显低于正常组(P<0.05),而柴朴汤组CADM1表达量明显高于肝郁型哮喘组(P<0.05),提示哮喘与CADM1的下调有关，柴朴汤能够疏肝解郁，化痰平喘，使用柴朴汤后CADM1的表达明显上调。

支气管哮喘的发病机制复杂，主要可概括为气道免疫-炎症机制、神经调节机制及其相互作用，而Th1与Th2细胞比例的失衡(Th1细胞的减少及Th2细胞的升高)是气道免疫-炎症机制的重要部分。IL-33是IL-1家族中的一员，它主要表达于上皮细胞和内皮细胞。受炎性因子影响后，IL-33的表达上调[14,15]。在哮喘的发病过程中，IL-33诱导Th2型免疫应答，并在树突状细胞、嗜酸性粒细胞和Th2细胞中与其ST2L结合并激活，从而加强炎症反应。孙博文等[16]研究提示IL-33可能与支气管哮喘的整个慢性炎症反应有关。本文肝郁型哮喘组中IL-33明显升高，提示IL-33参与了肝郁型哮喘发病的炎症过程，柴朴汤通过抗炎途径能够有效下调IL-33的表达。

与IL-33类似，TSLP(胸腺基质淋巴细胞生成素)作为一种上皮源性的细胞因子，主要是上调Th2表达。TSLP能够通过树突状细胞来调节体内天然免疫及适应性免疫，导致上皮细胞增生肥大、黏液分泌过多，加重炎症。在肝郁型哮喘组中，TSLP的蛋白表达及mRNA表达量均明显高于正常组，使用柴朴汤后，TSLP的表达量明显下调，这可能与柴朴汤的抗炎作用有关。

综上，在肝郁型哮喘小鼠中柴朴汤能上调CADM1、MAL的表达，下调IL-33、TSLP的表达。

文章来源：刘鑫,刘姿琴,杨苏琴,彭果然,肖琳琳.柴朴汤对肝郁型哮喘小鼠CADM1、MAL、IL-33、TSLP表达的影响[J].中南医学科学杂志,2021,49(05):502-505.