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辛麻颗粒对慢性哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能的影响

2024-05-19 39 上传者：管理员

摘要：【目的】探讨辛麻颗粒对慢性哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能的影响。【方法】将50只雌性BALB/C小鼠随机分成正常组、模型组、辛麻颗粒低剂量组、辛麻颗粒高剂量组、地塞米松组，每组10只。除正常组，其余各组小鼠采用卵清白蛋白（OVA）致敏和激发法建立慢性哮喘模型。给予相应干预后，采用酶联免疫吸附分析（ELISA）测定支气管灌洗液分泌型免疫球蛋白A(sIgA)、免疫球蛋白E(IgE)水平，苏木素-伊红（HE）染色法观察肺组织病理学改变，Western Blot法检测肺组织E钙黏蛋白（E-cadherin）表达。【结果】HE染色可见哮喘小鼠明显气道炎症。模型组小鼠支气管灌洗液sIgA浓度低于正常组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组sIgA浓度高于模型组（P<0.05）。模型组小鼠支气管灌洗液IgE浓度高于正常组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组IgE浓度低于模型组（P<0.05）。模型组小鼠肺组织E-cadherin蛋白相对表达量低于正常组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白相对表达量高于模型组（P<0.05）。辛麻颗粒高剂量组和地塞米松组各指标改善效果优于辛麻颗粒低剂量组（P<0.05），且2组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。【结论】辛麻颗粒可能通过改善气道炎症、增高呼吸道sIgA浓度、增强呼吸道E-cadherin蛋白的表达，提高哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能。

关键词：
E钙黏蛋白
sIgA
哮喘
气道炎症
辛麻颗粒
黏膜免疫
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辛麻颗粒为广东省第二中医院院内制剂，由经典名方小青龙汤合射干麻黄汤化裁而成，主要功效为止咳平喘、健脾化痰，临床应用可有效治疗哮喘[1]。课题组前期研究[2]表明，辛麻颗粒可以通过抑制辅助性T细胞2(Th2）优势的免疫作用，改善哮喘小鼠的气道炎症；但其作用机制尚不完全明确。气道上皮屏障功能异常是2型炎症发生发展的关键步骤[3]。因此，本研究拟观察辛麻颗粒对哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能的影响，探讨其干预机制，以期为辛麻颗粒临床应用提供理论依据，现将研究结果报道如下。

1、材料与方法

1.1 实验动物

50只SPF级雌性BALB/C小鼠，鼠龄6～8周，体质量17～21 g，购自广东省医学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（粤）2022-0002。于广东省第二中医院实验动物中心饲养，室温22～26℃，相对湿度45%～65%，标准饲料喂养，自由进食、饮水。本研究通过广东省第二中医院实验动物伦理委员会审查，审批号：049147。

1.2 药物、试剂与仪器

辛麻颗粒（5 g/包），广东省第二中医院院内制剂（批准文号：粤药制字Z20090021），药物组成：炙麻黄、细辛、法半夏、苏子、射干、陈皮、山药、丹参、五味子、补骨脂。地塞米松注射液（天津金耀集团湖北天药药业股份有限公司生产，批号：国药准字H42020019）。卵清白蛋白（ovalbumin,OVA）（美国Sigma公司）；小鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA）酶联免疫吸附分析（ELISA）试剂盒、小鼠免疫球蛋白E(IgE) ELISA试剂盒（美国RD公司）；E钙黏蛋白（E-cadherin）抗体（美国Cell signalling technology公司）；山羊抗兔IgG H&L(HRP）二抗（英国Abcam公司）。403H空气式压缩雾化器（中国鱼跃医疗公司）；2550型紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；Spectra MAX190型酶标仪（美国MD公司）；PowerPac基础电泳仪（美国Bio-Rad公司）；YD62型石腊包埋机、YD-AB型烤片机（均为浙江金华益迪公司产品）；DP2-BSW型病理图像采集系统（日本Olympus公司）。

1.3 分组、造模与给药

将50只小鼠适应性喂养1周后，随机分为5组，分别为正常组、模型组，辛麻颗粒低、高剂量组，地塞米松组，每组10只。模型的建立与给药处理：正常组，第1、14天每只小鼠腹腔注射0.2 mL生理盐水，以第21天起雾化吸入生理盐水30 min,3次/周，持续8周。模型组，参照文献研究[4]建立慢性哮喘模型，分致敏和激发两步，第1、14天每只小鼠腹腔注射0.2 mL致敏液（OVA 10µg，氢氧化铝凝胶100µg），第21天起雾化吸入OVA溶液（25 g/L，Ⅱ级）30 min,3次/周，持续8周。造模过程观察小鼠精神状态、皮毛、活动、呼吸、大小便以及进食状态，判断模型成功建立与否主要是从小鼠症状、体征及病理学改变来评估。辛麻颗粒低剂量组，在构建哮喘模型的基础上，从第21天开始每日2次灌胃辛麻颗粒水溶液至造模结束，1.3 g/kg（按动物体表面积比率换算等效剂量法）。辛麻颗粒高剂量组处理同辛麻颗粒低剂量组，剂量为2.6 g/kg；地塞米松组，在构建哮喘模型的基础上，第21天起每次雾化前30 min腹腔注射10 mg/kg地塞米松注射液[5],3次/周，持续8周。

1.4 观察指标与检测方法

1.4.1 ELISA法检测sIgA、IgE水平

各组小鼠末次激发24 h后行支气管灌洗。离断颈椎处死小鼠，医用胶布固定小鼠四肢，分离颈部皮肤、肌肉组织，分离气管，结扎右肺，左侧支气管置静脉穿刺套管针，0.9%冰浴生理盐水1 mL行支气管灌洗，每次气道内注入、回抽3次，回收液体量>80%。双抗体夹心ELISA法检测支气管灌洗液中sIgA、IgE浓度。按ELISA试剂盒说明书进行操作。应用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值，计算后得出sIgA、IgE的实际浓度。

1.4.2 HE染色法观察肺组织病理学改变

切取的小鼠右肺组织用0.9%生理盐水清洗血渍，10%多聚甲醛固定48 h，常规脱水，透明，石蜡包埋，制作蜡块，横切气管，切成厚度5µm薄片，行HE染色。

1.4.3 Western Blot法检测肺组织E-cadherin表达

取左肺组织剪碎，加入放射免疫沉淀分析（RIPA）裂解液（含蛋白酶和磷酸酶抑制剂），匀浆机匀浆，置于冰上裂解30 min，取上清液进行蛋白定量。将等量蛋白样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）后转至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上，脱脂牛奶室温封闭2 h，加入一抗E-cadherin(1∶1 000稀释），4℃孵育过夜，TBST洗膜。加入山羊抗兔IgG H&L(HRP）二抗（1∶2 000稀释），室温孵育1 h,TBST洗膜。增强化学发光（ECL）液显影，全自动化学发光成像分析系统成像，用ImageJ软件对条带进行灰度分析，计算目的蛋白相对表达量（目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值比值）。

1.5 统计方法

采用SPSS 25.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差表示。多组间比较采用单因素方差分析；多组样本均数两两比较，方差齐者用Bonferroni检验，方差不齐的多重比较用Dunnett’s T3法检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。

2、结果

2.1 各组小鼠一般状态比较

正常组小鼠动作灵活，毛发光亮，未见呼吸异常；模型组小鼠出现呼吸急促，点头呼吸，烦躁不安，腹肌抽搐，皮毛暗淡粗糙等表现；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组小鼠在雾化刺激后出现呼吸急促、腹肌抽搐等表现，但明显轻于模型组，哮喘样症状有所改善。

2.2 各组小鼠肺组织病理变化比较

图1结果显示：正常组小鼠气管及肺组织结构完整，无炎性细胞浸润；模型组小鼠气道壁、气道平滑肌明显增厚，黏膜下层增宽，皱褶增多，管腔狭窄，气管、支气管周围可见大量炎性细胞浸润；与模型组比较，辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组小鼠肺组织、气道炎性细胞浸润减少，气道壁及气道平滑肌增厚减轻，其中辛麻颗粒高剂量组、地塞米松组改善更明显。

图1各组小鼠肺组织病理学改变（HE染色，×200)

2.3 各组小鼠支气管灌洗液sIgA、IgE浓度比较

表1结果显示：模型组小鼠支气管灌洗液sIgA浓度低于正常组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组sIgA浓度高于模型组（P<0.05）；辛麻颗粒高剂量组、地塞米松组支气管灌洗液sIgA浓度高于辛麻颗粒低剂量组（P<0.05），且2组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

模型组小鼠支气管灌洗液IgE浓度高于正常组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组IgE浓度与模型组相比较均有降低（P<0.05）；地塞米松组IgE浓度显著低于辛麻颗粒高、低剂量组（P<0.05）；辛麻颗粒高、低剂量组IgE浓度比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

2.4 各组小鼠肺组织E-cadherin表达比较

表2、图2结果显示：与正常组比较，模型组小鼠肺组织E-cadherin蛋白相对表达量显著降低（P<0.05）；与模型组比较，辛麻颗粒高、低剂量组及地塞米松组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白相对表达量均升高（P<0.05）；辛麻颗粒高剂量组和地塞米松组E-cadherin蛋白相对表达量高于辛麻颗粒低剂量组（P<0.05），且2组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

表1各组小鼠支气管灌洗液sIgA、IgE浓度比较

表2各组小鼠肺组织E-cadherin蛋白相对表达量的比较

图2各组小鼠肺组织中E-cadherin蛋白的Western Blot电泳图

3、讨论

哮喘存在免疫功能紊乱。黏膜免疫系统是独立于细胞与体液免疫系统之外的一种复杂的免疫系统，就像一道屏障保护机体，是机体抵抗病原的第一道防线。气道上皮细胞为气道黏膜的重要构成，在维持机体气道免疫稳态中发挥重要作用[6]。气道上皮细胞作为引起哮喘气道炎症的靶细胞之一，暴露于环境因素和炎症后，易造成气道上皮反复损伤，修复和再生会导致气道黏膜上皮的组织学改变和功能异常[7]，诱导免疫系统异常信号传导、气道重塑以及气道高反应性，引起哮喘疾病的发生和发展[8]。

sIgA是机体黏膜防御系统的主要成分，主要由淋巴细胞归巢到黏膜中的B细胞产生，是黏膜应答过程中的主要效应因子，在呼吸道黏膜免疫反应中发挥关键作用[9]。提高sIgA水平可增强黏膜免疫功能，预防呼吸道疾病发生，遏制相关疾病的进展。体内sIgA缺乏或降低容易发生支气管哮喘等疾病[10]。本研究发现，辛麻颗粒能够提高哮喘小鼠呼吸道的sIgA水平，增强黏膜免疫功能。

IgE由黏膜下淋巴组织中的效应B细胞合成。哮喘发病中，IgE可作用于局部组织中肥大细胞和嗜碱性粒细胞的FcεRⅠ受体，促进炎性介质的释放，导致支气管收缩，气道平滑肌痉挛，同时导致杯状细胞大量分泌黏液，气道黏膜水肿，引起气道高反应性[11]。哮喘患者体内往往存在高水平的IgE并且与哮喘炎症的严重程度相关。本研究发现，辛麻颗粒可降低哮喘小鼠呼吸道的IgE水平，改善哮喘小鼠的气道炎症。

气道上皮屏障功能是黏膜免疫的重要组成部分。屏障蛋白E-cadherin对于细胞间的黏附起到重要的作用，是上皮细胞重要的生物标记物。E-cadherin主要表达于上皮细胞膜上，其表达减少使支气管上皮结构失去稳定性和上皮细胞丧失极性，有利于支气管上皮细胞的移行[12]。研究[13]表明，哮喘发生时E-cadherin的表达明显降低，在哮喘患者中E-cadherin蛋白表达水平越低，屏障功能缺失就越明显，而屏障功能缺失又会进一步促进哮喘的发生与发展。此次研究发现，使用辛麻颗粒干预后，哮喘小鼠肺组织E-cadherin蛋白表达增高，可以保护气道上皮屏障，改善哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能。

综上所述，辛麻颗粒能够改善气道炎症，降低呼吸道IgE水平，提高哮喘小鼠呼吸道sIgA浓度以及气道E-cadherin蛋白表达，进而增强哮喘小鼠呼吸道黏膜免疫功能，且辛麻颗粒高剂量作用效果优于低剂量，与地塞米松作用相当。

参考文献:

[1]吕子怡,宫静,吴淼萍.辛麻颗粒联合沙美特罗替卡松粉吸入剂治疗支气管哮喘的效果[J].临床误诊误治,2023,36(4):97-100.

[2]宫静,吴根英,杨琳.辛麻颗粒对哮喘小鼠胸腺基质淋巴细胞生成素分泌和Th2优势免疫作用的影响[J].中国中西医结合杂志,2018,38(7):855-858.

[3]钟剑,王畅畅,戚世权,等.钙池操纵的钙通道在屋尘螨诱导哮喘小鼠气道上皮屏障破坏中的作用[J].武汉大学学报(医学版),2023,4(20):19-24.

[5]陈培芬,罗雅玲,赖文岩,等.慢性哮喘小鼠肺组织巨噬细胞移动抑制因子的表达及地塞米松对其的调节[J].广东医学,2009,30(3):338-341.

[8]郑莉莉,李泽庚.基于哮喘黏膜免疫探讨“肺与大肠相表里”理论[J].陕西中医药大学学报,2016,39(4):15-18.

[9]宋桂华,彭明浩,张岩,等.加味小青龙汤治疗支气管哮喘慢性持续期临床疗效及对IL-6､IL-10､SIgA的影响[J].中华中医药学刊,2020,38(9):5-9.

[10]罗珍瑶,梁爱武. SIgA在呼吸道免疫中的作用及中医药干预研究进展[J].中西医结合心血管病电子杂志,2019,7(11):72-73.

[12]朱晓华,李秋根,汪俊,等.溴化结构域蛋白抑制剂JQ1对哮喘小鼠气道重塑作用机制研究[J].中国当代儿科杂志,2017,19(12):1278-1284.

[13]陶羽,刘兆国,季律,等. E-钙粘蛋白异常表达与支气管哮喘研究进展[J].中国药理学通报,2015,31(10):1333-1335.

基金资助:广东省中医药局科研项目(编号:20211028);广州市科技计划项目(编号:202102080453);