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荧光原位杂交技术检测CLL分子遗传学异常

2020-10-17 262 上传者：管理员

摘要：目的：探讨荧光原位杂交技术在慢性淋巴细胞白血病（CLL)诊断和预后评估中的价值。方法：采用RB1(13q14.1)、D13S25(13q14.3)、p53(17p13.1)、ATM(11q22.3)及CSP125组探针对93例初诊CLL患者进行检测,同期进行常规染色体核型分析。分析FISH检测出的遗传学异常与患者的临床Binet分期、Rai分期及其他检测指标的相关性。结果：93例初诊CLL患者分子遗传学异常检出率为79.6%(74/93),其中13q缺失（13q-)阳性率最高,占45.2%；其次为12号染色体三体（+12)占26.9%、p53缺失（17p-)占19.4%、ATM缺失（11p-)占17.2%。同时伴有2种及2种以上染色体异常患者27例（29.0%),其中13q-伴17p-者8例,13q-伴11q-者5例,13q-伴+12者4例。CC检测结果相比较,FISH检测结果中患者的阳性率非常显著高于CC检测结果（χ2=32.127,P<0.01)。FISH检测结果与Rai分期没有显著相关性（P>0.05),伴17p-的CLL患者Binet分期更晚（P=0.012)。各分子遗传学异常与患者年龄、外周血淋巴细胞计数绝对值和CD38表达水平之间均无显著相关性（P>0.05)。女性患者13q-的发生率（65.4%)显著高于男性患者（37.3%)(P=0.015);17p-患者IGHV未突变（U-IGHV)的比例显著高于17p-阴性患者（P=0.013);29.0%的患者表达CD38,且与临床分期及U-IGHV呈显著相关（P值分别为0.027及0.006)。结论：FISH技术能够大大地提高CLL患者分子遗传学异常的检出率,是常规细胞遗传学有力的补充,对CLL患者的临床分期及预后判断均有重要的应用价值。

关键词：
临床分期
慢性淋巴细胞白血病
染色体核型分析
荧光原位杂交
血液科
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慢性淋巴细胞白血病是一种B淋巴细胞克隆性增殖疾病,不同患者预后差别很大,细胞及分子遗传学异常是影响CLL进展和患者预后的重要因素。慢性淋巴细胞白血病染色体异常改变较多,其中以13号染色体（D13S25和RB1基因缺失）、12号染色体（12三体）、17号染色体（p53基因缺失）及11号染色体（ATM基因缺失）的异常较为常见[1]。本研究通过分析本院93例初诊CLL患者的临床特征与遗传学异常之间的关系,探讨FISH检测在CLL诊断和治疗中的作用及临床意义。

1、材料和方法

1.入组病例

联勤保障部队第九四○医院血液科2014年5月至2018年12月期间收治的初诊慢性淋巴细胞白血病患者93例。所有患者均行骨髓穿刺、流式细胞术等检查,同时行荧光原位杂交技术检测,以中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南（2015年版）[2]作为诊断和分型依据,其中男67例,女26例,中位年龄61(32-87）岁。

2.常规染色体核型分析

染色体标本取自患者骨髓细胞,经RPMI1640培养液24h短期培养后收获细胞,制备染色体标本并采用G显带技术进行核型分析,核型异常命名根据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》进行。每例患者尽可能分析中期分裂细胞20个,每例标本的核型至少经2位医师共同鉴定。

3.FISH检测及信号分析

组合探针RB1(13q14.1）、D13S25(13q14.3）、p53(17p13.1）、ATM(11q22.3）以及CSP12均购自广州安必平医药科技股份有限公司,应用上述探针检测13q-、17p-、11q-和12号染色体三体（+12）的异常情况。按照试剂盒提供的FISH操作说明书进行样本处理、变性,加入配制的探针,放入ThermoBriteTM原位杂交仪（美国自然基因有限公司）中,72℃变性5min,37℃杂交16h,然后洗脱、染色,在荧光显微镜下（日本Olympus公司BX51型）通过DAPI/PI/FITC三色滤光镜观察杂交信号。每份样本计数至少200个细胞,并记录杂交信号及统计各信号的百分率。以20例具有正常核型和非血液系统恶性疾病的患者作为正常对照,记录各种信号模式占总数的百分率,以百分率的平均值+3SD为阳性判别的阈值。探针阈值分别为RB1(6.5%）、D13S25(6.5%）、p53(6.0%）、ATM(6.0%）及CSP12(7.5%）,以异常细胞大于上述阈值作为阳性标准。

4.临床资料回顾性分析

对93例初诊CLL患者的临床资料进行回顾性分析,包括CLL患者的临床Rai和Binet分期及相关实验室检查,以及患者年龄、性别、初诊时外周血淋巴细胞绝对值计数、CD38和IGHV突变状态。采用流式细胞术检测CD38表达,以≥30%判断为高表达；IGHV突变状态采用多重PCR检测,以免疫球蛋白重链（IgH）序列同源性<98%定义为体细胞突变。

5.统计学分析

应用SPSS18.0软件对数据进行统计分析,计数资料使用频数及百分比描述,分类资料比较使用Pearsonχ2检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

1.染色体核型分析结果

93例CLL骨髓样本中,未见中期分裂相14例（15.1%,14/93）,正常核型43例（46.2%),36例（38.7%）检出染色体异常克隆,其中涉及+12或12号多倍体的共计17例（18.3%);del(13q）/-13的12例（12.9%);del(17p13）/-17的8例（8.6%);del(11q22）/-11的6例（6.5%）。有9例复杂染色体异常与本研究FISH检测所覆盖的区域不相关。通过χ2检验对2种检测方法所得数据进行比较。结果证实,FISH检测阳性率非常显著高于CC检测结果（χ2=32.127,P<0.01）（表1）。

2.FISH检测细胞遗传学异常的结果

93例CLL患者中,存在1种及1种以上分子遗传学异常的有74例,异常检出率为79.6%。检出del(13q)42例（45.2%）,其中单纯RB1基因（13q14）缺失占7.2%(3/42）,单纯D13S25基因（13q14.3）缺失占57.1%(24/42）,以上二者共同缺失占35.7%(15/42）。单等位基因患者的中位年龄是57(45-79）岁,双等位基因患者的中位年龄是68(46-80）岁,说明双等位基因缺失是晚期事件,第二个等位基因的缺失发生在疾病的晚期。93例患者中12号染色体三体（+12)25例（26.9%）,中位年龄是66(50-77）岁；17p-患者18例（19.4%）,中位年龄是65(50-80）岁；11q-者16例（17.2%）,中位年龄是66(42-87）岁。同时伴有2种及2种以上染色体异常患者27例（29.0%）,其中,13q-伴17p-者占29.6%(8/27）,中位年龄为65(58-80）岁；13q-伴11p-者占18.5%(5/27）,中位年龄是60(45-75）岁；13q-伴+12者占14.8%(4/27）,中位年龄是68(62-75）岁；同时伴有2种以上染色体异常者占14.8%(4/27）,中位年龄是69(52-77）岁（表2）。

细胞遗传学异常与其他临床指标相关性的分析结果

比较FISH检测出的细胞遗传学异常与患者的一般特征和预后指标（临床分期、外周血淋巴细胞绝对值计数、CD38和IGHV）的相关性。结果发现,各分子遗传学异常与患者年龄、Rai分期、外周血淋巴细胞计数绝对值和CD38表达水平之间无显著相关性（P>0.05）；女性患者13q-阳性率（65.4%）显著高于男性患者（37.3%）,差异具有统计学意义（P=0.020);FISH检测结果与Binet分期具有相关性,伴17p-的CLL患者Binet分期更晚（P=0.012);17p-患者IGHV未突变状态（U-IGHV）的比例显著高于17p-阴性患者（P=0.013）（表3）。

3.CD38表达分析结果

93例CLL患者中,27例患者CD38表达阳性（29.0%）。CD38+的患者中,BinetA期患者7例（25.9%),B期患者7例（25.9%),C期患者13例（48.1%）；而在CD38-患者中3期患者比例分别为48.5%、30.3%和21.2%。由此可以看出,CD38+患者中Binet中高危患者（BinetB-C期）比例更高（P=0.027）。CD38+的患者中,51.9%的患者为U-IGHV状态,显著高于CD38-患者U-IGHV的比例（22.7%）,可见CD38阳性表达与U-IGHV状态呈显著相关（P=0.006）（表4）。

3、讨论

CLL是一种低度恶性的淋巴细胞增殖性疾病,在西方国家约占白血病患者总数的30%,在我国约为3.4%[3]。细胞遗传学异常往往都与CLL患者的治疗及预后密切相关,是CLL危险度分层的重要因素[4]。由于CLL细胞大多处于间期,其增殖能力低下,通常常规细胞遗传学分析显示为正常核型；而FISH技术可以同时检测间期细胞和中期细胞的染色体异常,具有较高的敏感性,能够快速准确地检测出常规核型分析不能辨别的DNA小片段（1-103kb）改变[5]。因此,FISH技术的应用可以大大地提高CLL患者细胞遗传学异常的检出率。

本研究采用组合探针FISH和常规染色体核型分析（CC)2种方法,检测了93例初诊CLL患者骨髓细胞染色体异常情况。FISH检测阳性检出率显著高于染色体核型分析检测的结果（79.6%vs38.7%)(P<0.01）。这表明FISH检测的检出率要优于CC技术,与文献报道[6,7]相符。但FISH探针的选择具有局限性,所以染色体核型分析仍旧不能被FISH技术所取代,对于初诊CLL患者应同时进行FISH及CC检测,以期发现更多的细胞遗传学异常。

在本研究中,涉及13q-的D13S25和RB1基因缺失占45.2%,是CLL染色体异常中发生频率最高的事件,这与国外的报道[8]一致。有研究认为,D13S325和RB1探针在检测13q14缺失上无差异,2者同时存在提示较大片段缺失[9],本研究中D13S325基因缺失的阳性率高于RB1基因（25.8%vs3.2%）,以上2者共同缺失占16.1%。这说明,13q-既可以是小片段缺失,也可以涉及较大片段缺失。同时,女性患者13q-阳性率显著高于男性患者（P=0.020）。研究表明,性别差异具有一定预后价值,如女性患者治疗后的总体反应率更高,且OS时间较男性患者显著延长[10]。93例CLL患者中伴17p-的患者18例（19.4%）,较国外报道的5%-10%比例[11]更高。伴17p-的患者在诊断时Binet分期更晚（P=0.012),IGHV未突变状态（U-IGHV）的比例显著高于17p-阴性患者（P=0.013）。这说明,该部分患者病情进展更快,侵袭性更高,p53基因缺失（17p-）或者突变会严重干扰细胞的分化和凋亡,导致肿瘤细胞持续增长且肿瘤容易转移,并对化疗药物不敏感,这也正是p53基因缺失或突变的患者预后差的原因之一[12]。+12发生在26.9%的患者中,与高增殖活性及中等预后相关,中位总生存期为114个月[13]。ATM基因位于11号染色体的长臂2区2带（11q22.3）上,是一种DNA损伤反应基因,其表现为对辐射的高度敏感和肿瘤易发倾向,并与激活肿瘤抑制基因p53有关[14]。本研究的16例11q-阳性的患者中,Bient分期为B-C期的患者为12例,说明伴11q-的患者病程呈高度侵袭性,疾病进展迅速。

研究表明,IGHV未突变（U-IGHV）的患者较IGHV突变（M-IGHV）的患者疾病病程进展更快、生存期更短[15],因为CLL逃避IGHV可获得抗原持续刺激以促进肿瘤克隆增殖。本研究发现IGHV在不同预后染色体中的分布有差异,17p-阳性患者U-IGHV的比例显著高于17p-阴性患者（P=0.013）,这也从侧面证实了影响CLL患者预后的细胞遗传学异常中,伴17p-患者预后最差[16,17]。CD38是一种与淋巴细胞活化、分化发育等生物学进程密切相关的Ⅱ类跨膜糖蛋白,约33%-42%的CLL患者伴CD38表达,是CLL患者独立的预后指标[18]。本研究中,29.0%的患者表达CD38,比例与国外报道[19]相近,且与IGHV未突变状态及临床分期均呈显著相关（P值分别为0.027及0.006）。

综上所述,应用FISH技术能够大大地提高CLL患者细胞遗传学异常的检出率,是CC技术的有力补充,并且各细胞遗传学异常与多种临床指标相关,采用FISH结合临床指标进行综合判断,可能对于评价患者病情和辅助临床分期有重要作用。由于条件有限,本研究无法准确对细胞遗传学异常的CLL患者进行预后评估,今后需对这些患者进行长期随访,观察疾病进展及治疗情况,为CLL患者的诊断、个体化治疗及预后评估提供可靠依据。

参考文献:

[2]中华医学会血液学分会、中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会.中国慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤的诊断与治疗指南(2015年版).中华血液学杂志,2015,36(10):809-813.

[7]荆源,林樉,王芳婷,等.荧光原位杂交技术检测43例慢性淋巴细胞白血病患者基因异常.中国实验血液学杂志,2018,26(4):1038-1043.

张海英,杨艳丽,赵强,张京,白海.荧光原位杂交技术检测慢性淋巴细胞白血病分子遗传学异常[J].中国实验血液学杂志,2020,28(05):1474-1479.