更年宁，收载于《卫生部药品标准（中药成方制剂）》第六册，由柴胡、黄芩、人参等22味药组成，剂型包括水蜜丸和大蜜丸，具有疏肝解郁、益气养血、健脾安神的功效[1]。处方中首味药柴胡，来源于伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.(B.chinense DC.）或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根[2]。柴胡近源品种较多，近年来柴胡需求量大增，市场上常有柴胡混伪品作药用的情况[3-5]。其中，藏柴胡为常见伪品，藏柴胡为伞形科植物窄竹叶柴胡Bupleurum marginatum Wall.ex DC.var.stenophyllum(Wolff)Shan et Y.Li(B.marginatum Wall.ex DC.var.stenophyllum）的干燥根[6-7]。因其资源量大、价格低、性状与柴胡相近、柴胡皂苷含量高，市场上存在藏柴胡掺入柴胡使用的情况[8-9]。研究表明，藏柴胡具有抑制流感病毒活性、解热、抗炎等作用[10]；但动物实验表明，服用藏柴胡的小鼠出现明显的中毒症状，而相同生药量柴胡并未呈现毒性[11]。藏柴胡掺伪柴胡使用，使得临床用药安全性和有效性受到很大威胁。

含柴胡的中成药有500余种，《中国药典》等标准中采用柴胡对照药材进行定性鉴别，或以柴胡皂苷a和柴胡皂苷d对照品进行定量分析。目前，含柴胡中成药标准仅能控制柴胡不投料或少投料情况，因藏柴胡中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量较柴胡高，现行标准无法检查柴胡投料真伪，不法企业利用此漏洞以藏柴胡掺伪或替代柴胡投料。更年宁现行质量标准缺乏柴胡的质量控制项目[1]，为有效控制更年宁的质量，提高临床用药的安全性和有效性，本研究以藏柴胡的特征性成分尼泊尔柴胡皂苷K为基础[12-15]，采用UPLC-MS/MS技术检查更年宁中藏柴胡掺伪的情况，为柴胡在中药制剂中掺伪投料的监管提供技术支持。

1、仪器与试药

Thermo Fisher TSQ Altis三重四极杆液相色谱-质谱联用仪（赛默飞世尔公司）；XPE205电子天平（十万分之一，Mettler Toledo公司）；KQ-300DA型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司；超声功率：300 W；频率：40 kHz）。

尼泊尔柴胡皂苷K对照品（批号：112073-202201，含量以94.2%计）、柴胡对照药材（批号：120992-201509）（中国食品药品检定研究院），藏柴胡对照药材（批号：WXHY-ZCH-001，天津万象恒远科技有限公司）。甲醇、氨水（分析纯），乙腈、甲酸（质谱级），水为Milli-Q系统制备。

收集到柴胡样品12批、藏柴胡样品12批，经河南省药品医疗器械检验院刘亚楠副主任中药师鉴定分别为伞形科植物柴胡B.chinense DC.的干燥根、伞形科植物窄竹叶柴胡B.marginatum Wall.ex DC.var.stenophyllum的干燥根；更年宁水蜜丸44批次（5个企业）均为2022年国家药品抽检样品。

2、方法与结果

2.1色谱-质谱条件

采用Waters BEH C18色谱柱（2.1 mm×50 mm,1.7μm），以乙腈（A)-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0～3 min,25%～30%A;3～30 min,30%～50%A;30～31 min,50%～90%A;31～34 min,90%A;34～35min,90%～25%A;35～40 min,25%A）；流速0.3m L·min-1，柱温35℃；进样量1μL。

采用电喷雾离子源（ESI），负离子扫描，多反应监测（MRM）模式，离子喷雾电压2.5 kV，鞘气50 Arb，辅助气10 Arb，蒸发温度350℃，离子传输管温度325℃。选择m/z 943.5→635.4（定量离子对）、m/z 943.5→797.5（定性离子对）和m/z 943.5→781.5（定性离子对）为尼泊尔柴胡皂苷K的检测离子对，碰撞能量均为45 eV。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备溶液

取尼泊尔柴胡皂苷K对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含100μg的对照品储备溶液。

2.2.2供试品溶液

取更年宁水蜜丸适量，研碎，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入含5%浓氨试液的甲醇溶液25 mL，密塞，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用5%浓氨试液的甲醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3藏柴胡药材溶液

取藏柴胡药材约0.1 g，按“2.2.2”项下方法制备，精密吸取续滤液1 mL，置10 mL量瓶中，用含5%浓氨试液的甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4柴胡药材溶液

取柴胡药材约0.1 g，精密称定，按“2.2.2”项下方法制备，即得。

2.2.5柴胡阴性样品溶液

按更年宁水蜜丸处方比例及工艺自制柴胡阴性样品1批，按“2.2.2”项下方法制备柴胡阴性样品溶液。

2.3方法学研究

2.3.1专属性考察

取“2.2”项下对照品溶液、供试品溶液、柴胡阴性样品溶液，依照“2.1”项下条件检测，结果显示，柴胡阴性样品中特征离子对均未检出，阴性样品无干扰。尼泊尔柴胡皂苷K的保留时间为4.40 min，其MRM提取离子流图见图1。

2.3.2基质效应考察

更年宁水蜜丸处方药味众多，柴胡投料量占比较低（约占处方量2.9%），故需对制剂基质效应进行考察。基质效应对照品溶液：精密量取3734 ng·m L-1的尼泊尔柴胡皂苷K对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。基质效应标准加入溶液：精密量取3734 ng·m L-1的尼泊尔柴胡皂苷K对照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，用柴胡阴性样品溶液稀释至刻度，摇匀，即得。取上述2种溶液，分别进样测定，以基质效应标准加入溶液峰面积与基质效应对照品溶液峰面积的比值计算基质效应。

结果，基质效应标准加入溶液m/z943.5→635.4的色谱图中尼泊尔柴胡皂苷K色谱峰的峰面积为248 907，基质效应对照品溶液相应色谱峰面积为259 008，计算得出基质效应为96.1%，表明样品基质对尼泊尔柴胡皂苷K的测定基本无干扰。

2.3.3线性关系考察及定量限测定

精密量取“2.2.1”项下对照品储备液适量，以甲醇配制系列浓度（n=5）对照品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，以尼泊尔柴胡皂苷K进样质量浓度（X,ng·mL-1）为横坐标，峰面积值（Y）为纵坐标对X进行线性回归，得回归方程为Y=674.88X+7051.2(r=0.9998），线性范围为93.3～3734 ng·mL-1。

将对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3∶1时的对照品质量浓度为检测限，10∶1时的对照品质量浓度为定量限。结果更年宁水蜜丸中尼泊尔柴胡皂苷K的检测限为3.7ng·m L-1，定量限为7.5 ng·m L-1。

2.3.4精密度试验

取尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度为186.7 ng·mL-1的对照品溶液，连续进样6次，以m/z 943.5→635.4的色谱图中尼泊尔柴胡皂苷K色谱峰的峰面积进行计算，结果RSD(n=6）为1.1%，表明仪器精密度良好。

2.3.5重复性试验

分别精密称取同一更年宁水蜜丸样品（B企业，批号：210401)6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下条件进样测定，测得尼泊尔柴胡皂苷K的平均含量为14.9μg·g-1,RSD为0.80%，表明该方法的重复性良好。

2.3.6稳定性试验

取“2.3.5”项下同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1”项下条件进样，测定峰面积，结果尼泊尔柴胡皂苷K峰面积的RSD为1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7回收试验

精密称取已知尼泊尔柴胡皂苷K含量的更年宁水蜜丸样品（B企业，批号：210401）粉末1.0 g共9份，置具塞锥形瓶中，以3份为一组，分别按相对于本品约50%、100%、200%的3个含量比例精密加入尼泊尔柴胡皂苷K对照品溶液，按“2.2.2”项下方法操作，即得。进样测定，计算加样回收率。结果尼泊尔柴胡皂苷K在3个浓度水平的加样回收率（n=3）分别为96.4%、99.6%、97.9%,RSD分别为2.9%、0.80%、1.9%，表明该方法回收率良好。

图1对照品溶液（A）、供试品溶液（B）和柴胡阴性样品溶液（C）的MRM提取离子流图

2.4藏柴胡掺伪检查的限度拟订研究

2.4.1药材中尼泊尔柴胡皂苷K的测定

取不同批次的藏柴胡及柴胡药材各0.1 g，精密称定，分别按“2.2.3”和“2.2.4”项下方法制备藏柴胡及柴胡药材溶液。按“2.1”项下条件进样分析，计算尼泊尔柴胡皂苷K的含量。结果表明，柴胡及藏柴胡中均含有尼泊尔柴胡皂苷K，藏柴胡中尼泊尔柴胡皂苷K的含量是柴胡的40倍左右，见表1。

表1柴胡药材和藏柴胡药材中尼泊尔柴胡皂苷K的含量

2.4.2掺伪比例与尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度的线性关系考察

取柴胡对照药材，分别以含藏柴胡3%、5%、10%、25%、50%、100%的比例制备不同掺伪比例的柴胡原料，按更年宁水蜜丸处方比例及工艺制备模拟掺伪样品，按“2.2.2”项下方法制备溶液，进样分析。不同掺伪比例样品中尼泊尔柴胡皂苷K的质量浓度分别为145.8、240.6、338.7、721.7、1538.5、3406.2 ng·m L-1。以尼泊尔柴胡皂苷K的质量浓度（Y）为纵坐标，掺伪比例（X）为横坐标，进行线性回归，计算得回归方程为Y=33.332X-6.9116(r=0.9947）。结果表明，藏柴胡掺伪比例在3%～100%与尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度呈良好的线性关系，该方法可对更年宁水蜜丸中藏柴胡掺伪量进行定量检测。

2.4.3掺伪判定浓度的拟订

参照2020年版《中国药典》四部“0212药材和饮片检定通则”所述杂质通常不得过3%，考虑柴胡存在交叉种植、种质多样及性状易混淆的情况，而柴胡药材中均含有微量尼泊尔柴胡皂苷K，同时结合更年宁水蜜丸制法与柴胡处方量，为防止限度拟订过低造成假阳性结果，本研究拟订更年宁水蜜丸中藏柴胡的掺伪限度为10%。

以12批藏柴胡药材、1批藏柴胡对照药材分别按含藏柴胡10%的比例掺入柴胡对照药材，按更年宁水蜜丸处方比例及工艺制备13批藏柴胡掺伪比例为10%的参比掺伪样品，按“2.2.2”项下方法制备其溶液，进样分析，根据“2.3.3”项下回归方程计算尼泊尔柴胡皂苷K的浓度，结果见表2。参比掺伪样品溶液中尼泊尔柴胡皂苷K的平均质量浓度为271.6 ng·m L-1，拟订更年宁水蜜丸供试品溶液中尼泊尔柴胡皂苷K的质量浓度不得超过272ng·m L-1，并以此浓度作为检查更年宁水蜜丸中是否存在藏柴胡掺伪的判定质量浓度。更年宁水蜜丸为全粉入药制剂，折算成更年宁水蜜丸中尼泊尔柴胡皂苷K的含量限度为不得过3.4μg·g-1。

表2 13批藏柴胡制备掺伪10%藏柴胡的参比溶液检测结果

2.5样品测定及结果分析

取44批更年宁水蜜丸样品各2份，分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项下条件进样测定，以随行标准曲线计算含量，结果见表3。5批样品（B企业，批号分别为210201、210202、210401、210601、210602）尼泊尔柴胡皂苷K含量超出拟订限度，提示藏柴胡掺伪投料。将上述样品尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度分别代入“2.4.2”项下掺伪比例与尼泊尔柴胡皂苷K质量浓度的线性方程，5批样品藏柴胡掺伪比例在22%～36%。B企业样品中，上述问题样品生产日期集中在2021年2月至6月，2021年下半年至2022年年初样品未发现藏柴胡掺伪投料情况。提示B企业应加强原料质量控制，严格把好入库关。

3、讨论

3.1供试品溶液制备方法考察

考察不同溶剂（甲醇、含5%浓氨试液的甲醇溶液、乙腈），提取方式（回流、超声），提取时间（回流0.5、1 h，超声15、30、45 min）的提取效果。结果含5%浓氨试液的甲醇溶液提取效果优于甲醇或乙腈溶液，采用超声提取30 min结果最优。

3.2色谱-质谱条件优化

3.2.1流动相条件考察

对流动相组成（甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水）进行优化，结果以乙腈-0.1%甲酸水为流动相进行梯度洗脱，峰形对称、出峰时间稳定、分离度最佳。

3.2.2色谱柱的选择

表3更年宁水蜜丸中尼泊尔柴胡皂苷K含量测定结果(μg·g-1)

考察了3种色谱柱WatersBEH C18(1.7μm,2.1 mm×50 mm）、YMC-Triart C18(1.9μm,2.1 mm×100 mm）、YMC-Triart C18(3μm,2.1 mm×150 mm）对分离的影响。结果显示，粒径3μm的色谱柱分离度不佳；粒径1.7μm和1.9μm的色谱柱各项方法学均满足要求，粒径1.7μm的色谱柱呈现的峰分离度和峰形更好。故本方法采用1.7μm色谱柱进行检测。

3.2.3检测离子对的选择

电喷雾负离子模式下可检出尼泊尔柴胡皂苷K的分子离子峰，选取丰度最高的分子离子峰[M-H]-943.5为母离子，选择m/z 943.5→635.4、m/z 943.5→797.5和m/z943.5→781.5为尼泊尔柴胡皂苷K的检测离子对，其中m/z 943.5→635.4的色谱峰响应值最大、分离度好、信噪比高，故选择该离子对作为定量离子对。

3.3基质效应考察

基质效应是指在对分析物的浓度或质量测定过程中，来自样品中其他化合物的一种或几种综合的影响。可通过比较空白样品加标与采用纯溶剂配制的同样浓度的对照品溶液的测定值确认基质效应的有无及强弱[16]。若基质效应在85%～115%内，可以认为基质效应不明显[17]。本研究基质效应为96.1%，无需采用基体匹配校准法、标准加入法等方法消除基质效应。

4、结论

本研究首次建立了UPLC-MS/MS法检查更年宁水蜜丸中藏柴胡掺伪的方法，该方法可靠性强，快速便捷，可为评价更年宁水蜜丸等含柴胡中药制剂中柴胡投料掺伪情况提供技术支撑。

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基金资助:2022年国家药品抽检(中央补助地方经费项目)(No.41);河南省市场监督管理局科技计划项目(No.2023sj61);中国药品监管科学行动计划第二批重点项目(No.NMPAJGKX-2023-029);

文章来源:蒋芦荻,杨琰,刘亚楠,等.基于UPLC-MS/MS技术的更年宁水蜜丸中藏柴胡掺伪方法的研究[J].中南药学,2024,22(12):3345-3350.