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同二聚体提升Aβ蛋白荧光探针性能

2023-09-14 35 上传者：管理员

摘要：本研究根据经典的D-π-A结构设计了荧光探针M2，为进一步优化提高探针的对于β-淀粉样（Aβ）蛋白斑块的检测功能，本文利用端氨基烷基链将两个M2单体染料连接起来，形成同二聚体，增加对蛋白亲和力，并利用扭转分子内电荷转移(TICT)，提高对蛋白响应性和信噪比。

关键词：
β-淀粉样蛋白
同二聚体
荧光探针
蛋白亲和力
阿尔兹海默症
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Aβ蛋白斑块作为阿尔兹海默症（AD）的一项重要特异性标志，是临床诊断AD的重点对象，因此开发靶向脑内Aβ斑块的荧光探针具有重要的临床诊断和治疗意义[1]。Aβ蛋白斑块根据聚集程度不同分为寡聚体和纤维，两种蛋白聚集体皆具有毒性，目前研究已证明，在AD发病进程早期聚集的Aβ寡聚体具有更强的神经毒性，并且是导致细胞膜内外离子失衡，神经元凋亡的主要风险因素[2]，因此对Aβ寡聚体具有更高辨识度的探针对于病理探究和诊断具有更重要的意义[3]。

目前主流靶向Aβ蛋白的探针通常根据分子电荷转移（ICT）机理设计[4]，探究出了许多探针，大多因部分缺陷而被淘汰。虽然目前研究者已开始关注其他发光机理如聚集诱导发光（AIE）以弥补目前存在的缺陷[5]，但这些缺陷的探针因此被淘汰，实属可惜。

鉴于上述讨论，本文合成D-π-A构型单体染料，选用氰基酯类作为电子受体，采用N,N-二甲基苯环为电子供体，烯烃双键作为桥，合成M2分子，后用端氨基烷基链将两个M2单体染料连接起来，形成同二聚体D2，根据光学表征结果证明D2分子在对Aβ蛋白亲和力和信噪比方面都更优于M2。

1、实验部分

1.1主要实验材料

4-二甲基氨基肉桂醛(N1)、氰乙酸甲酯（A1）均购于Adamas，均为优级纯。乙二胺、哌啶、正丁醇、二甲亚砜（DMSO）、甲醇购于国药集团，药品均为分析纯。PBS缓冲溶液购于Solarbio分析纯。Aβ42多肽购自苏州强耀科技公司，PC12细胞购自丰辉生物公司。

1.2实验仪器

核磁共振仪器（Bruker AvanceⅢ400MHz）；荧光分光光度仪（岛津RF-6000）；高分辨质谱（Thermo Exactive Plus）；共聚焦激光扫描显微镜（Zeiss LSM 880）。

1.3探针分子合成

分子M2合成：N1(0.267 g,1.78 mmol）投入圆底烧瓶中，加入30 m L正丁醇，A1 (0.179 g,1.80 mmol）,加入4滴哌啶，氮气保护下回流4 h。待冷却至室温，冷藏过夜，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到暗红色粉末固体M2(0.241 g，产率：52%）。

分子D2合成：A1(0.80 g,8.07 mmol）投入到圆底烧瓶中，加入15 m L甲醇，加入乙二胺（0.10g,1.67 mmol），氮气保护下回流6 h，待冷却至室温，冷藏过夜，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到白色粉末状固体，1,2-二（氰基乙酰氨基）乙烷（0.11 g,0.56 mmol）。将4-二氨基肉桂醛（0.258 g,1.47mmol）投入圆底烧瓶中，加入30 ml正丁醇，而后加入1,2-二（氰基乙酰氨基）乙烷（0.095 g,0.49mmol），加入4滴哌啶，在氮气保护下回流4 h,待冷却至室温，冷藏过夜，抽滤，甲醇洗涤，干燥得到暗红色粉末固体D2(0.14 g，产率56%）。

1.4探针及Aβ寡聚体和纤维溶液配置

将探针分子D2和M2溶于DMSO溶液中，配备成浓度为5μM和50μM的储备液。

Aβ蛋白两种聚集体制备如下：0.1 mg Aβ42肽，加入10μL DMSO助溶，PBS定容1 m M浓度，PBS进行稀释至实验所需浓度的样品。该样品在25℃下培养1天，得到Aβ蛋白寡聚体溶液。该样品在37℃下培养7天，得到Aβ蛋白纤维状聚集体溶液。

1.5信噪比及解离常数Kd测定

配备得到的探针浓度为5μM的探针分子溶液，在荧光光度仪狭缝设定为10.0 nm的条件，M2和D2分别在465 nm和478 nm进行以下测试。将固定量探针分子M2和D2溶液分别加入到的Aβ寡聚体和纤维溶液中，改变蛋白的浓度，利用PBS缓冲溶液进行定容，测荧光强度，得到信噪比。

荧光滴定法测定探针解离常数（Kd）。固定Aβ蛋白纤维和寡聚体浓度分别为3μM和4μM，分别用浓度为0-2μM的M2和D2浓度探针分子溶液进行滴定，监测荧光强度信号，直到荧光曲线趋向于平稳。后将样品浓度及其相对应的荧光强度导入软件Graph Pad prism，通过非线性单位点拟合，得到Kd值。

1.6探针细胞毒性及分子成像

使用噻唑蓝（MTT）法检测探针细胞毒性。将PC12细胞移至96孔板中，培养24 h，加入不同浓度的探针分子。培养24 h，去除废弃培养基，并用PBS冲洗细胞。加入200μL/孔的MTT,2 h后去除，加入DMSO振荡10 min。使用酶标仪测量各孔吸光度值，根据吸光度计算细胞存活率，平行实验3次。

将D2分子溶液(50μM)，分别与寡聚体和原纤维等比例混合，水浴孵化25 min。将混合液滴在干净载玻片上，盖上载玻片。干燥后，共聚焦激光扫描显微镜获得荧光成像图。

2、结果与讨论

2.1探针M2和D2的核磁和质谱结构表征

根据以上表征结果，确定分子M2和D2成功合成。

2.2探针与Aβ寡聚体信噪比

图1(a)M2与寡聚体信噪比图（b)D2与寡聚体信噪比图

从图1a-b比较得D2背景信号更低，在32μM的浓度D2信噪比更强，D2和M2相对背景信号强度提升倍数为5.86和4.14，证明柔性连二聚体的扭转分子内电荷转移（TICT）态被抑制明显，非辐射衰减得到抑制，信噪比显著提高。

2.3探针与Aβ纤维信噪比

图2(a)M2与Aβ纤维信噪比图（b)D2与Aβ纤维信噪比图

如图2a-b对比所示，D2比M2对于Aβ原纤维的响应更优。D2和M2因为Aβ纤维疏水空腔结构与寡聚体不同，受到寡聚体到纤维转变，粘度极性等微环境的改变，信噪比提升不如与寡聚体，在32μM浓度下同背景信号荧光强度相比提升倍数为2.57和1.35。但二聚体因为同受到TICT态的抑制，信噪比这一指标同样提升明显。

2.4探针与Aβ寡聚体的解离常数（Kd)

图3a-b所示，D2曲线快速达到饱和平衡趋势，M2分子达到饱和平衡趋势过程缓慢。拟合该曲线可以得到Kd值，D2和M2的Kd值为0.1163和0.7590。Kd值越低，对蛋白亲和力越高。二聚体D2因为多探头靶向蛋白位点能力变强，能够提升蛋白的有效摩尔浓度，加快动力学结合过程及亲和力。

图3 (a) M2与寡聚体Kd(b)D2与寡聚体Kd

2.5探针与Aβ纤维的解离常数（Kd)

图4 (a) M2与Aβ纤维解离常数(b)D2与Aβ纤维解离常数

根据图4a-b曲线拟合得到，D2和M2与Aβ纤维的Kd值为0.1823和1.878。M2达平衡趋势缓慢，D2快速达到平衡趋势，二聚体不仅因多探头与蛋白结合动力学过程和亲和力提高，并且分子结构狭长能与Aβ纤维疏水空腔更好的结合，获得更高蛋白亲和力。

2.6细胞毒性测试

图5(a)M2细胞毒性实验（b)D2细胞毒性实验

从图5a-b中对比得随着探针浓度的增加，D2细胞存活率都高于90%，比M2细胞存活率更高。同二聚体由于分子链延长导致的结构柔性更强，平面刚性结构降低，与分子生物膜作用时表面亲和力更高，生物相容性提高。

2.7荧光成像

图6a为D2与寡聚体的成像，说明该二聚体可以准确靶向到寡聚体受到激发荧光成像，具有对寡聚体的检测功能。图6b为D2与纤维的清晰成像，证明D2靶向检测Aβ纤维成像，D2为一款合格的检测Aβ聚集体探针。

图6(a)D2寡聚体成像（b)D2纤维成像