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头风痛丸中8种成分的HPLC法测定及其化学计量学综合评价

2021-09-29 134 上传者：管理员

摘要：目的建立头风痛丸中氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯的HPLC法测定方法及其化学计量学综合质量评价方法。方法使用WatersSymmetryshieldC18柱(250mm×4.6mm,5μm),以甲醇–0.1%冰醋酸溶液为流动相,梯度洗脱,检测波长分别为310nm(0～22min检测氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素)、280nm(22～60min检测川洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯),柱温30℃,体积流量1.0mL/min,进样量10μL。采用统计软件对头风痛丸中8种成分的含量数据进行主成分分析与聚类分析。结果8种成分的线性范围分别为14.27～356.75、10.85～271.25、4.09～102.25、0.58～14.50、0.96～24.00、2.54～63.50、1.22～30.50、4.89～122.25μg/mL(r≥0.9992);平均加样回收率分别为100.05%、99.50%、99.38%、97.32%、96.98%、97.78%、96.93%、98.91%,RSD值分别为0.66%、0.59%、1.13%、0.99%、1.22%、1.07%、1.41%和0.78%(n=9)。15批样品提取出3个主成分,聚类分析分成2类。结论以氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯同步测定的HPLC法可用于头风痛丸多指标质量评价。

关键词：
主成分分析
头风痛丸
异欧前胡素
欧前胡素
氧化前胡素
聚类分析
高效液相色谱
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头风痛丸由白芷、川芎和绿茶加工而成，有祛风止痛的功效，主要用于偏头痛、眉棱骨痛、额窦炎，对于偏头痛引起的头痛、眉棱骨痛、眩晕、心烦易怒、失眠多梦、口干口苦等症状有明显的改善作用[1]。头风痛丸处方中白芷可以解表散寒、祛风止痛、宣通鼻窍，其主要药效成分为香豆素类成分（氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素）；川芎能活血行气、祛风止痛，主要含内酯类成分（洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯和藁本内酯）。头风痛丸的标准[2]和相关文献报道[3,4]均仅对欧前胡素进行定量分析。中药材及中药复方制剂中化学成分复杂，单一质控指标很难全面反映产品的整体质量差异，因此为全面保障头风痛丸的质量多方位可控性，本实验采用HPLC法对头风痛丸中氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯8种成分进行了同步定量分析，同时将两个厂家15批头风痛丸样品的测定数据采用统计软件进行聚类分析和主成分分析，以期为头风痛丸标准的提升和质量全面监管提供方法。

1、仪器与试药

WatersAlliance2695型高效液相色谱仪（Waters公司）；AB265-S型电子分析天平（瑞士梅特勒–托利多公司）。

欧前胡素（质量分数99.0%，批号110826-201918）、异欧前胡素（质量分数99.6%，批号110827-201812）对照品均购自中国食品药品检定研究院；氧化前胡素（质量分数99.5%，批号PRF20110643）、洋川芎内酯I（质量分数98.0%，批号PRF15121423）、洋川芎内酯A（质量分数99.5%，批号PRF8031301）、瑟丹酸内酯（质量分数98.5%，批号PRF20033024）、藁本内酯（质量分数99.2%，批号PRF8070601）对照品均购自成都普瑞法科技开发有限公司，洋川芎内酯H对照品（质量分数99.6%，批号17092822）购自上海同田生物技术有限公司。甲醇为色谱级别，乙酸为分析纯。

头风痛丸分别购自吉林吉春制药股份有限公司（规格6g/袋，批号190203、190302、190801、190901、191102、200603、200801、201102，编号依次为S1～S8）、吉林省康福药业有限公司（规格6g/袋，批号20190302、20190604、20191101、20191103、20200302、20201102、20201103，编号依次为S9～S15）。

2、方法与结果

2.1溶液的制备

2.1.1对照品溶液的制备

取各对照品适量，用70%甲醇制成氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯质量浓度分别为2.854、2.170、0.818、0.116、0.192、0.508、0.244、0.978mg/mL的混合贮备液。精密吸取混合贮备液适量，用70%甲醇稀释20倍，作为对照品溶液（8种成分的质量浓度分别为142.7、108.5、40.9、.5.8、9.6、25.4、12.2、48.9μg/mL）。

2.1.2供试品溶液的制备

取头风痛丸适量，研细后取2g，精密称定于锥形瓶中，精密加70%甲醇25mL，称定质量，加热回流45min，放冷补足质量，摇匀，0.45μm滤膜滤过，即得。按头风痛丸标准中的处方和制法，分别制备不含白芷、川芎的阴性供试品，同法制成阴性供试品溶液。

2.2色谱条件

WatersSymmetryshieldC18柱（250mm×4.6mm,5μm），以甲醇–0.1%冰醋酸溶液为流动相，梯度洗脱（0～10.0min,35.0%甲醇；10.0～22.0min,35.0%→58.0%甲醇；22.0～48.0min,58.0%→80.0%甲醇；48.0～60.0min,80.0%→35.0%甲醇），检测波长分别为310nm(0～22min检测氧化前胡素、欧前胡素和异欧前胡素）[5,6,7,8,9]、280nm(22～60min检测川洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯）[10,11,12,13]，柱温30℃，体积流量1.0mL/min，进样10μL。

2.3线性关系考察

精密吸取混合贮备液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL，分别用70%甲醇定容至20mL，得到6个混合对照品溶液，分别依法进样分析，以质量浓度对相应峰面积进行线性回归，结果见表1。

2.4系统适用性

对照品溶液和供试品溶液依法进样分析，结果见图1。结果头风痛丸供试品溶液中8种目标成分与相邻色谱峰分离度均大于1.5，理论板数按8种成分计均大于5500，并且阴性供试品对8种成分的检测无干扰。

2.5精密度试验

取对照品溶液，依法连续进样分析6次，测定峰面积值，计算得氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯峰面积的RSD值分别为0.53%、0.76%、1.04%、1.29%、1.12%、0.98%、1.18%、0.88%。

2.6重复性试验

取头风痛丸样品（编号S1)6份，制备供试品溶液，依法进样分析，计算得氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯质量分数的RSD值分别为1.32%、1.47%、1.66%、1.89%、1.74%、1.61%、1.80%、1.53%。

2.7稳定性试验

取头风痛丸供试品溶液（编号S1）于配制后0、2、6、12、18、24h依法进样分析，计算得氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯峰面积的RSD值分别为0.64%、0.90%、1.13%、1.36%、1.25%、1.07%、1.29%、1.11%，表明头风痛丸供试品溶液在24h内稳定。

2.8回收率试验

取头风痛丸（编号S1)9份，研细后每份取1g，精密称定，3份作为1组，每组分别精密加入对照品溶液（氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯的质量浓度分别为1.792、1.397、0.576、0.089、0.134、0.351、0.167、0.708mg/mL)0.8、1.0、1.2mL，制备供试品溶液，依法进样分析，计算得8种成分的平均回收率分别为100.05%、99.50%、99.38%、97.32%、96.98%、97.78%、96.93%、98.91%,RSD值分别为0.66%、0.59%、1.13%、0.99%、1.22%、1.07%、1.41%、0.78%(n=9）。

2.9样品测定

取头风痛丸样品15批（编号S1～S15），制备供试品溶液，依法进样分析，按外标法计算氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯的质量分数，结果见表2。

2.10化学计量学分析

2.10.1聚类分析

为考察不同厂家、不同批次头风痛丸中氧化前胡素、欧前胡素、异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I、洋川芎内酯A、瑟丹酸内酯、藁本内酯含量的差异，使用SPSS26.0统计软件，采用组间连接聚类法，以欧氏距离为测度，对两个厂家的15批头风痛丸测定数据进行分析（图2）。结果显示，15批头风痛丸样品聚为2类，样品S1～S8和S9～S15各聚为一类。从分类结果可以看出，同一厂家生产的头风痛丸聚为一类，可能与生产厂家所用设备、生产过程控制参数有关；但同一厂家的产品中目标化合物含量仍有一定波动，可能与生产时所用的原药材产地、采收季节、炮制方法相关。因此在生产过程中，需要固定原药材来源，细化炮制参数，确保产品均一、稳定、安全。

2.10.2主成分分析

采用SPSS26.0统计软件对两个厂家的15批头风痛丸测定数据进行主成分分析，将表2测得的数据导入软件，得到表3、4。可以看出，以特征值大于1为提取标准，前3个主成分的累积方差贡献率达到87.470%。异欧前胡素、洋川芎内酯H、洋川芎内酯I和洋川芎内酯A组成了主成分1的信息，是对第1主成分影响较大的特征向量；氧化前胡素、欧前胡素和藁本内酯组成了主成分2的信息，是对第2主成分影响较大的特征向量；瑟丹酸内酯组成了主成分3的信息，是对第3主成分影响较大的特征向量。