卵巢癌发病率位居女性妇科肿瘤第三，死亡率仅次于宫颈癌[1,2],严重危及广大女性的生命健康[3,4]。卵巢癌早期没有典型症状，缺乏有效且明确的筛查手段，高达70%的患者就诊时即为晚期，5年生存率仅30%[5,6]。目前临床治疗卵巢癌主要以手术联合化疗为主。手术治疗易导致术后绝经，化疗耐药严重影响预后，且易复发[7,8]。因此，深入研究卵巢癌的发病机制，挖掘新型分子靶向药物，从而提高疗效、改善预后、降低死亡率是目前亟待解决的问题。中医理论认为，卵巢癌多因气滞血瘀、湿热蕴结而成，治则多以“行气化瘀，清热祛湿，化痰解毒”为主。复方双草莲是由夏枯草、冬凌草、半边莲、半枝莲等中药组成。现代药理学研究表明，夏枯草具有抑制肿瘤细胞增殖的作用，并诱导肿瘤细胞凋亡[9]。冬凌草甲素通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路抑制卵巢癌细胞迁移和侵袭[10]。半枝莲、半边莲因其能抑制肿瘤生长、协同化疗、减少不良反应，在临床被广泛用于治疗各类肿瘤。本研究通过网络药理学和体外实验探究复方双草莲促进卵巢癌细胞凋亡及自噬的机制。

1、材料与方法

1.1药物、试剂与仪器

RPMI1640培养基(AJ3073457,思拓凡公司),胎牛血清(DF29-570026,思拓凡公司),青链霉素(2307001,索莱宝公司),胰蛋白酶(J230012,思拓凡公司),顺铂(421R021,上海源叶),CCK-8试剂盒(C6005,NCM Biotech),TUNEL染色试剂盒(20231014,索莱宝公司),膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(AnnexinⅤ-FITC/PI)凋亡检测试剂盒(AK13200,Elabscience)。主要仪器：超高效液相色谱仪(Thermo Vanquish UHPLC)、高分辨质谱(Q-Exactive HF,Thermo Fisher Scientific),全自动多功能酶标仪(Spectra Max M2e, Molecular Devices),流式细胞仪(Accuri C6,BD Biosciences),荧光显微镜(BX53,OLYMPUS)。

1.2色谱串联质谱分析

称取夏枯草、半边莲、半枝莲各100 g,冬凌草300 g,制备水煎剂。甲醇制备样品溶液，上机检测。根据二级质谱信息利用多个数据库进行物质鉴定。

1.3网络药理学分析

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)及中医药百科全书(ETCM)数据库筛选复方双草莲的有效活性成分及其相应靶点，GenesCard和Disgenet等数据库获取卵巢癌相关靶点，韦恩在线分析工具筛选出药物靶点和疾病靶点的交集部分，构建蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络，根据度值分析核心靶点及核心有效成分，使用AutoDock、Pymol等软件进行分子对接，使用DAVID数据库进行基因本体论(GO)功能富集和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，利用Cytoscape软件构建成分-靶点-疾病网络关系。

1.4复方含药血清的制备

60只SD雄性大鼠适应性喂养1 w,随机分为空白对照组、复方双草链低、中、高剂量组各15只。复方双草莲低、中、高剂量组分别予以0.018、0.055、0.160 g/kg药液灌胃(中剂量组相当于人用剂量8倍),空白对照组给予同等体积的生理盐水灌胃，2次/d,连续灌胃5 d。末次给药1 h后取血，离心收集上清，0.45/0.22μm过滤器过滤，-80℃冷冻保存。基础RPMI培养基与复方含药血清按照10∶1比例混合均匀，加入1%青链霉素，配制成低、中、高剂量的含药培养基。本研究所包含的动物实验均通过长春中医药大学伦理审查批准(批准编号：2024173)。

1.5人卵巢癌细胞(SKOV3)培养

SKOV3在完全培养基中37℃、5%CO2条件下培养。含药培养基处理细胞，将细胞分为空白对照(Control)组、复方双草莲低剂量(FU-L)组、复方双草莲中剂量(FU-M)组、复方双草莲高剂量(FU-H)组及顺铂阳性药物(Cisplatin)组。

1.6细胞增殖实验

取对数生长期的SKOV3以2×104的密度接种于96孔板中，每组6复孔，用含药培养基及顺铂(0.1μmol/L)处理细胞12、24、48 h,加入CCK-8孵育3 h。酶标仪450 nm处测定吸光度，根据吸光度绘制生长曲线，计算细胞存活率，实验重复3次取平均值。

1.7克隆生存实验

SKOV3以1×105个接种于6孔板中，给药处理24 h,每隔3 d更换培养基，肉眼观察细胞集落形成，磷酸盐缓冲液(PBS)清洗，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色液染色10 min,流水冲洗，晾干拍照。

1.8细胞划痕实验

取对数生长期的细胞接种于6孔板上，移液管尖端做划痕，在显微镜下记录划痕相对距离，药物处理12、24 h,再次记录划痕相对距离，计算迁移率。

1.9流式细胞术检测细胞凋亡

SKOV3以1×105的密度接种于6孔培养板中，药物处理24 h, 1 000 r/min离心5 min,预冷的PBS重悬细胞，离心，结合缓冲液重悬，加入AnnexinⅤ-FITC和PI染液，室温黑暗条件下孵育15 min,流式细仪检测。

1.10 TUNEL染色检测细胞凋亡

细胞专用爬片放置于24孔板中，接种细胞并孵育过夜，含药培养基孵育24 h, 4%多聚甲醛固定，TUNEL染色液避光孵育1 h,梯度脱水后滴加含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的抗荧光猝灭封片剂(避免产生气泡)封片，荧光显微镜观察。

1.11 Western印迹检测蛋白表达

SKOV3以1×106的密度接种于6孔板中，给药24 h,冰浴裂解20 min, 4℃离心提取总蛋白。等量蛋白电泳后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封闭液封闭1 h,一抗4℃孵育过夜。二抗室温下孵育1 h,化学发光试剂盒和成像系统检测蛋白质条带，ImageJ分析蛋白水平。

1.12免疫荧光

细胞专用爬片放置于24孔板中，接种细胞并孵育过夜，给药孵育24 h, 4%的多聚甲醛固定液固定，0.2%TritonX-10通透，二喹啉甲酸(BCA)封闭30 min,一抗4℃过夜，荧光二抗室温避光孵育1 h,含DAPI的抗荧光淬灭封片剂封片，荧光显微镜观察。

1.13统计学分析

采用GraphPad Prism8.0.2软件进行单因素方差分析。

2、结 果

2.1色谱串联质谱分析

根据物质相对浓度获取冬凌草甲素、胆碱、咖啡酸等正负离子模式下前20的化合物，获得其有效化合物，从而进行药物作用靶点的筛选，为后续网络药理学预测药物作用靶点提供有效依据。

2.2网络药理学分析

TCMSP数据库及ETCM数据库获取复方双草莲有效活性成分71个，根据口服利用度(OB)≥30%,类药性(DL)≥0.18筛选靶点蛋白504个。GeneCards数据库及DisGenet数据库获得卵巢癌的治疗靶点3 500个。在线韦恩获得药物与疾病的交集靶点共169个。Cytoscape软件构建有效活性成分与靶点及疾病之间关系网络见图1,红色箭头代表复方中药组分，黄色三角形表示疾病，外圈蓝色菱形为有效活性成分，内圈绿色方形是有效成分与疾病相关联的靶点基因。STRING数据库构建交集靶点的PPI网络图，共159个节点，609条边，平均节点度值为7.99,平均介数为0.388。利用Cytoscape软件中的hubba插件进行核心靶点的筛选，最终获得度值前10名的核心靶点，见图2,其颜色的深浅代表着度值的高低，颜色越深度越高。将前十靶点与其相对应的活性成分进行分子对接，发现蛋白激酶B(AKT)可能是关键治疗靶点，后续实验将进一步验证。GO富集分析说明，与生物过程(BP)相关的项目共818个；与细胞成分(CC)相关的项目73个；与分子功能(MF)相关的项目150个。同时还获得了164个KEGG富集通路，其中大多与癌症相关通路有关。

图1复方中药-有效活性成分-核心靶点基因-疾病关系网络

2.3复方双草莲抑制SKOV3细胞增殖、迁移及集落形成

与Control组比较，FU-L、FU-M、FU-H组细胞存活率显著降低，且呈明显剂量依赖性(P<0.05);复方双草莲高剂量组24 h细胞存活60%左右，48 h低于50%,因此后续实验选24 h为药物作用时间。与Control组相比，复方双草莲处理后SKOV3细胞集落数量呈剂量依赖性显著下降(P<0.05)。复方双草莲能够有效抑制SKOV3细胞迁移，且呈明显剂量依赖性(P<0.05)。而复方双草莲各剂量组与Cisplatin组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。顺铂作用于SKOV3能有效杀伤SKOV3。见表1、图3。

2.4复方双草莲促进SKOV3细胞凋亡

复方双草莲高剂量处理24 h后细胞凋亡能力明显增加，TUNEL染色荧光强度明显高于Control组(P<0.05)。免疫荧光结果显示，与Control组相比，复方双草莲各剂量组Bcl-2荧光强度显著降低。复方双草莲各剂量组B细胞淋巴瘤(Bcl)-2相关X蛋白(Bax)及胱天蛋白酶(Caspase)3蛋白表达增高，Bcl-2蛋白表达显著降低，且呈明显剂量依赖性(P<0.05)。而复方双草莲各剂量组与Cisplatin组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1、图4～6、表2、图7。

图2度值前10倍的核心靶点

表1复方双草莲对SKOV3细胞增殖、迁移及集落形成的影响

图3复方双草莲对SKOV3细胞集落形成、迁移能力的影响(×200)

图4流式细胞仪检测各组细胞凋亡

图5各组细胞凋亡(TUNEL染色，×400)

红色荧光表明凋亡细胞

图6复方双草莲对SKOV3细胞Bcl-2表达的影响(免疫荧光，×400)

蓝色荧光显示DAPI染色的细胞核，绿色荧光显示Bcl-2表达

2.5复方双草莲促进SKOV3细胞自噬

免疫荧光结果显示，复方各剂量组微管相关蛋白轻链(LC)3表达有所降低。Western印迹结果显示，与Control组比较，复方双草莲各剂量组Bax、Caspase3及自噬相关蛋白(Beclin) 1蛋白表达明显增加，Bcl-2、P62、微管相关蛋白轻链LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、PI3K、AKT蛋白表达明显降低(P<0.05)。复方双草莲各剂量组与Cisplatin组以上指标差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2、图7、图8。

表2复方双草莲对SKOV3细胞Bax、Bcl-2、Caspase3、PI3K、AKT、Beclin 1、P62、LC3蛋白表达的影响

图7各组SKOV3中Bax、Bcl-2、Caspase 3、PI3K、AKT、Beclin 1、P62、LC3蛋白表达的影响

图8复方双草莲对SKOV3细胞LC3表达的影响(免疫荧光，×400)

蓝色荧光显示DAPI染色的细胞核，绿色荧光显示LC3表达

3、讨 论

卵巢癌为女性高发恶性肿瘤之一，严重威胁女性生命健康。卵巢癌早期仅表现为轻微腹痛腹胀，临床难以诊断[11]。目前临床治疗以细胞减灭术联合放化疗为主。中草药目前广泛用于癌症治疗，抑制肿瘤增殖的同时显著提高患者的生存质量。复方双草莲具有清热解毒，化瘀散结等功效。临床发现，复方双草莲有效阻遏卵巢癌发展，抑制肿瘤细胞集落形成及迁移。

细胞凋亡为细胞死亡有效机制之一，通过促使胞膜破裂、胞核断裂等方式，有效控制细胞数量及肿瘤细胞增殖[12]。目前促进细胞凋亡是靶向治疗癌症的常见方式[13]。本研究表明，复方双草莲能够抑制卵巢癌细胞增殖。随着复方双草莲药物浓度的增加，集落形成数量显著降低。迁移实验证明了复方双草莲能抑制卵巢癌迁移，均呈剂量依赖性。复方双草莲能够有效促进肿瘤细胞凋亡。抗凋亡基因Bcl-2与促凋亡基因Bax之间的平衡维持细胞稳态[14],Caspase家族成员在细胞凋亡的启动和执行过程中发挥了关键作用[12,14]。本研究结果表明，复方双草莲通过调控Bax、Bcl-2等凋亡相关蛋白从而促进肿瘤细胞凋亡。

自噬主要通过自我吞噬聚集的蛋白质及受损的细胞器来实现细胞自身代谢，维持细胞生物合成[15,16]。自噬在癌症发生发展中发挥着双向调节作用，与细胞微环境及肿瘤恶性程度密切相关。早期自噬抑制肿瘤进展，当肿瘤发展至晚期时自噬能够促进肿瘤的生长[17,18]。将胞内物质运送到溶酶体降解，从而为肿瘤生长提供所必需的能量及代谢产物，因此晚期抑制自噬能够有效促进细胞凋亡[19,20]。大量研究表明，Beclin1与肿瘤的发生有着密切联系，在细胞增殖中发挥重要作用[21,22]。自噬的发生主要以自噬起始蛋白Beclin1为中心，产生自噬起始复合物促进自噬[23,24]。Beclin1是形成自噬小体及促进自噬体成熟的关键物质，与BCL-2相互作用共同协调细胞自噬与凋亡[22,25]。LC3被认为是与自噬体膜稳定结合的蛋白，LC3包括两种形式：LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ,自噬小体与溶酶体结合后，LC3-Ⅱ就会被水解[26,27]。P62是一种自噬标志物，能够修饰自噬小体的底物，通常与LC3-Ⅱ结合一起被水解[28]。复方双草莲各剂量组P62及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达降低，表明复方双草莲可能是通过促进SKOV3细胞自噬诱导其凋亡从而抑制卵巢癌进展。有研究表明，PI3K-AKT-mTOR信号通路参与多种生物过程，是目前癌症治疗的有效靶点[29]。PI3K是一种脂质激酶，主要参与调控细胞自噬[30]。AKT与PI3K结合时进行磷酸化[27]。mTOR是PI3K-AKT信号通路的下游负调控自噬的关键因子[30]。大量研究表明，抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路能够有效促进自噬的激活，诱导细胞凋亡，抑制肿瘤增殖及迁移[31]。这与本实验结果一致，说明复方双草莲是通过下调PI3K-AKT-mTOR信号通路抑制卵巢癌细胞自噬，促进凋亡，抑制肿瘤增殖。

综上，复方双草莲促进SKOV3细胞自噬诱导其凋亡来抑制卵巢癌细胞的增殖及迁移。但复方双草莲对于卵巢癌的作用机制尚未研究透彻，仍需进一步深入挖掘。

参考文献:

4庞艳.人文关怀在卵巢癌术后化疗护理中的应用及对患者不良反应的影响[J].中国医学创新,2019;16(27):77-80.

5中国抗癌协会妇科肿瘤专业委员会.卵巢恶性肿瘤诊断与治疗指南(2021年版)[J].中国癌症杂志,2021;31(6):490-500.

9潘庆华,魏文斌,曾莉蓉,等.白毛夏枯草水提取物对胃癌细胞增殖､凋亡的影响[J].中国老年学杂志,2024;44(3):705-9.

10何静,严如根,金国钰,等.冬凌草甲素体内外抗卵巢癌活性及相关机制研究[J].郑州大学学报(医学版),2023;58(4):480-9.

基金资助:吉林省科技发展计划项目医药健康产业发展专项(20210401061YY);吉林省卫生健康科技能力提升项目(2022JC047);

文章来源:张茹,张兆鹏,于子晴,等.基于自噬信号通路探讨复方双草莲抗卵巢癌的作用及机制[J].中国老年学杂志,2024,44(20):4986-4993.