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浓缩当归丸质量标准的提高及阿魏酸的含量测定研究

2020-12-29 396 上传者：管理员

摘要：目的:对浓缩当归丸的质量标准进行完善和提高,将现有浓缩当归丸或者当归丸(浓缩丸)的标准进行统一。方法:采用薄层色谱法(TLC)对浓缩当归丸中当归进行定性鉴别;采用高效液相色谱法(HPLC),以阿魏酸作为检测指标,进行定量测定。结果:薄层色谱法能有限的鉴别浓缩当归丸中的当归药材,阴性无干扰;阿魏酸在1.22～39.01μg•mL-1浓度范围内线性关系良好,回归方程为Y=4.89×104X-0.83×104,r2=0.9999;检测限为0.25ng,定量限为0.75ng;平均加样回收率为99.75%,RSD为1.88%(n=6)。测定样品16批,含量测定结果在0.16～0.43mg•g-1之间。结论:新建立的质量标准将原有的当归药材鉴别整合,并增加了阿魏酸的含量测定项,使质量的可控性更强,实验操作性更强;建立的实验方法准确可靠,简便快捷,适用性良好,可用于该制剂的质量控制和质量评价。

关键词：
浓缩当归丸
药剂学
薄层色谱法
质量标准
阿魏酸
高效液相色谱法
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浓缩当归丸由当归1味中药组成,具有活血补血,调经止痛的功效。主要用于血虚萎黄,月经不调,经行腹痛。浓缩当归丸现行标准收载于卫生部药品标准第十七册[1],检验项目较简单,没有【含量测定】项。同时,卫生部药品标准中药成方制剂第十五册上还收载有当归丸(浓缩丸)[2],其与浓缩当归丸的处方组成、制法、规格以及功能与主治均相近或者相同,考虑其属于同物异名,该标准检验项目也很简单。两个标准对产品质量的可控性较差,亟待提高。本文结合处方组成及工艺情况对该品种的检验检测方法进行了研究。目前关于浓缩当归丸或者当归丸(浓缩丸)的报道不多,主要为浓缩当归丸,多为其中阿魏酸的定量分析[3,4,5,6],研究较为系统完善。本实验参考《中华人民共和国药典》(以下简称《中国药典》)2015年版一部当归及当归流浸膏项下的方法[7],建立了当归、阿魏酸以及藁本内酯的薄层鉴别方法,用于控制处方中当归的质量;并选择阿魏酸作为检测指标,建立了浓缩当归丸中阿魏酸的HPLC含量测定方法,用于控制成品的质量。本实验对更简单有效地控制浓缩当归丸的质量,提供了技术支持。

1、仪器与试药

1.1仪器

Watetse2695高效液相色谱仪,配二极管阵列(PDA)检测器(美国Waters公司);KQ-600DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);色谱柱1:XSelect®CSHTMC18(4.6mm×250mm,5μm);柱2:ZORBAXSB-C18(4.6mm×250mm,5μm);柱3:ChromCoreTMPolarC18(4.6mm×250mm,5μm)。薄层层析硅胶板(青岛海洋化工厂分厂)。

1.2试药

当归对照药材(批号120927-201617),阿魏酸对照品(批号110773-201614,含量99.0%),藁本内酯对照品(批号111737-201910)均购自中国食品药品检定研究院。浓缩当归丸(A企业10批,批号分别为190101,190102,191101,191102,200101,140201,140202,140203,140204,140205;B企业3批,批号分别为150803,190420,190425;C企业3批,批号分别为19H7,19H9,19H10)。乙腈为色谱纯(购自默克股份两合公司),其他试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1当归薄层色谱鉴别

取本品粉末1g,加1%碳酸氢钠溶液50mL,超声(功率:600W,频率:40kHz)处理10min,离心,取上清液用稀盐酸调pH值至2～3,用乙醚振摇提取2次,每次20mL合并乙醚液,挥干,残渣加甲醇1mL使溶解,作为供试品溶液。另取当归对照药材0.5g,同法制成对照药材溶液。再取阿魏酸对照品、藁本内酯对照品,加甲醇分别制成每1mL含1mg的溶液,作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2015年版四部通则0502)试验,吸取上述四种溶液各1μL,分别点于同一硅胶G薄层板上,以环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)为展开剂,展开,取出,晾干,置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中,在与对照药材色谱和藁本内酯对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;在与阿魏酸对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝色荧光斑点。

该方法经过不同厂家薄层板,不同温湿度等耐用性验证考察,色谱斑点清晰易辨,分离度较好,阴性无干扰,样品色谱图详见图1。

2.2阿魏酸HPLC含量测定

本实验要求避光操作。

2.2.1色谱条件及系统适用性试验

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.085%磷酸溶液(17∶83)为流动相;检测波长为316mn;柱温35℃。进样量10μL。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5000。对照品溶液、供试品溶液和缺当归阴性对照溶液色谱图见图2。

2.2.2对照品溶液的制备

取阿魏酸对照品适量,精密称取阿魏酸对照品9.85mg,置10mL量瓶中,加70%甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为阿魏酸对照品储备液。精密量取上述储备液0.1mL,置10mL量瓶中,加70%甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。

2.2.3供试品溶液的制备

取本品适量,研细,取约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%甲醇25mL,密塞,称定,超声处理30min,放冷,再称定,用70%甲醇补足减失的质量,摇匀,静置,取上清液滤过,取续滤液,即得。

图1当归鉴别TLC图

图2对照品溶液(A)、样品溶液(B)和缺当归阴性溶液(C)的高效液相色谱图

2.2.4线性关系考察

取“2.2.2”项下对照品储备液,分别精密量取适量,加70%甲醇制成每1mL含阿魏酸1.22μg、2.44μg、4.88μg、9.75μg、19.50μg、39.01μg的系列溶液,吸取10μL注入液相色谱仪,以峰面积Y为纵坐标,浓度X为横坐标,绘制标准曲线,计算回归方程(n=6):

Y=48907.6X-8274.1r2=0.9999

阿魏酸在1.22～39.01μg·mL-1浓度范围内线性关系良好。

2.2.5检出限和定量限的确定

将浓度为1.22μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液,稀释成每1mL约含0.025μg的溶液,精密量取10μL进样,所得信噪比为3,作为检出限(LOD=0.25ng);将浓度为1.22μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液,稀释成每1mL约含0.075μg的溶液,精密量取10μL进样,所得信噪比为10,作为定量限(LOQ=0.75ng)。

2.2.6精密度试验

取同一浓度的阿魏酸对照品溶液(浓度9.75μg·mL-1)10μL,按上述色谱条件下重复进样6次,阿魏酸平均峰面积值为480156,RSD为0.71%(n=6),表明方法精密度良好。

2.2.7重复性试验

取同一样品(批号191101),按供试品溶液制备方法平行制备6份,测定阿魏酸含量,6份样品平均值为0.239mg·g-1,RSD为0.73%(n=6),表明方法重复性良好。

2.2.8加样回收率试验

精密称取已知含量的样品9份,每份0.25g,分别精密加入相当于0.25g样品中阿魏酸含量50%、100%、150%的阿魏酸对照品溶液(分别精密量取浓度为1.22μg·mL-1、2.44μg·mL-1、4.88μg·mL-1的阿魏酸对照品溶液25mL),各3份,按供试品溶液的制备方法制得加样回收样品溶液。分别吸取上述溶液各10μL测定,结果见表1。

表1加样回收率试验结果

2.2.9稳定性试验

取同一供试品溶液(批号190425),分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h、24h,精密吸取10μL进样,阿魏酸色谱峰峰面积的平均值为209963,RSD为1.74%(n=8),表明供试品溶液在24h内稳定性良好。

2.2.10专属性试验

按处方比例及工艺制备缺当归阴性样品,制备阴性样品溶液,同供试品溶液制备方法操作,结果表明阴性样品无干扰。

2.2.11耐用性试验

分别选用了3根不同品牌的色谱柱,取同一供试品溶液,精密吸取10μL进样,记录色谱图,结果阿魏酸峰均能与其他成分达到良好的分离(分离度大于1.5)。色谱柱1～3的理论板数分别为19700、15179、17380;阿魏酸峰面积分别为244898、257111、244962。结果表明本方法对不同色谱柱耐用性良好。

2.2.12样品测定

取样品16批,按供试品溶液的制备方法制备,依上述方法测定阿魏酸含量,结果见表2。

3、讨论

3.1当归薄层色谱鉴别

3.1.1展开剂的选择

分别参照《中国药典》2015年版一部当归【鉴别】(2)和【鉴别】(3),将当归药材、阿魏酸、藁本内酯点于同一硅胶G薄层板上,同时展开。结果阿魏酸在展开剂为正己烷-乙酸乙酯(9∶1)和正己烷-乙酸乙酯-甲酸(9∶1∶0.1)时比移值基本为0,未展开,当归药材和藁本内酯可以展开。展开剂参照当归【鉴别】(3)项下的展开剂环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-加酸(4∶1∶1∶0.1)展开时,则都可展开。因此,选用环己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-甲酸(4∶1∶1∶0.1)为展开剂。

表216批样品阿魏酸含量测定结果表

3.1.2提取方法的选择

提取方法也分别参考了当归【鉴别】(2)和【鉴别】(3),用石油醚(30～60℃)代替乙醚振摇10min,取上清液进行点样,发现供试品色谱中与阿魏酸相应位置无斑点,改用当归【鉴别】(3)项下提取方式,先用石油醚(30～60℃)代替乙醚,发现供试品色谱中与阿魏酸相应位置仍无斑点,最后完全按照当归【鉴别】(3)项下提取方式进行提取,点样展开后,供试品色谱中,在与对照药材色谱和藁本内酯对照品色谱相应的位置上,显相同颜色的荧光斑点;在与阿魏酸对照品色谱相应的位置上,显相同的蓝色荧光斑点。因此,提取方法完全参照当归【鉴别】(3)项下提取方式进行提取。

3.1.3点样量的考察

点样量考察了1μL和2μL的区别,点样量较大时,供试品中阿魏酸斑点与其相邻的斑点不易分开,给鉴别造成干扰。因此选用点样量为1μL。

3.2阿魏酸含量测定

3.2.1检测波长的选择

取阿魏酸对照品溶液进样后,PDA提取光谱图,结果显示阿魏酸在322.8nm处有最大吸收,316nm处吸收也较大,干扰较小,且与《中国药典》2015年版一部当归检测波长一致,因此,选择316nm作为检测波长。

3.2.2供试品溶液的制备方法选择

参考《中国药典》2015年版一部当归【含量测定】项下方法所用提取溶剂(70%甲醇)及提取时间(30min),对取样量及提取方法进行选择。先将取样量和提取方式确定,发现“0.5g超声30min”与“0.5g加热回流30min”和“1g加热回流30min”提取效果较好。考虑到实验操作的简易程度,选择“0.5g超声30min”。然后,对提取溶剂进行了考察,结果发现用70%甲醇超声提取效果最好。最后,对提取时间进行了考察,结果发现“超声30min”提取效果最好。

3.2.3柱温的选择

比较了25℃、30℃、35℃、40℃四种不同柱温下所得供试品色谱图,综合考虑分离度、出峰时间以及色谱柱的耐用性,最后选择35℃作为检测柱温。

参考文献：

[1]卫生部药品标准·中药成方制剂·第十七册[S].1998:187.

[2]卫生部药品标准·中药成方制剂·第十五册[S].1997:64.

[3]王兰,杨芳,王蕾.高效液相色谱法测定浓缩当归丸中阿魏酸的含量[J].陕西科技大学学报,2003,21(4):34.

[4]邵玉玲,强百杰,刘专专,等.HPLC法测定浓缩当归丸中阿魏酸的含量[J].分析测试技术与仪器,2007,13(3):211.

[5]宋纯.RP-HPLC法测定浓缩当归丸的阿魏酸含量[J].中国医药导刊,2008,10(4):634.

[6]赵子明,曹英莉.高效液相色谱法测定浓缩当归丸中阿魏酸含量[J].中国药业,2010,19(10):30.

[7]中华人民共和国药典2015年版.一部[S].2015:133,401.

徐金玲,樊磊磊,王雪芹,张竞,陈茂钦,杨秋红.浓缩当归丸质量标准的提高及阿魏酸的含量测定研究[J].中国药品标准,2020,21(06):510-514.