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HPLC法测定柴胡舒肝丸(大蜜丸)中香附烯酮和α-香附酮的含量

2023-10-10 243 上传者：管理员

摘要：本研究建立了柴胡舒肝丸中香附烯酮和α-香附酮含量测定方法。利用ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250mm,5μm)色谱柱,以甲醇-水(64:36)作为流动相,流速为1.0mL/min,检测波长为254nm,柱温30℃,进样体积5μL。采用HPLC法,测定香附烯酮和a-香附酮含量分别在0.211～2.112μg(R2=1.000)和0.080～0.804μg (R2=1.000)的范围呈良好线性;香附烯酮和α-香附酮的精密度、稳定性(24 h)、重复性试验的RSD均小于2.0%(n=6);加样回收率分别为94.9%(RSD=2.0%)和98.1%(RSD=1.6%)。测定样品4批,香附烯酮的含量为0.10～0.41 mg/丸,α-香附酮含量为0.19～0.28mg/丸。本方法简单易操作,专属性和准确度良好,为提高柴胡舒肝丸的质量标准提供参考依据。

关键词：
α-香附酮
含量测定
柴胡舒肝丸(大蜜丸)
疏肝理气
香附烯酮
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柴胡舒肝丸是由茯苓、豆蔻、酒白芍、麸炒枳壳和醋香附等25味药组成的大蜜丸或小蜜丸，临床主要功效疏肝理气，消胀止痛。其用于肝气不舒，胸肋痞闷，食滞不清，呕吐酸水。质量标准最早收载于《卫生部药品标准中药成方制剂第二册》，自从1995年版《中国药典》至今，一直收载于《中国药典》一部中[1]，其质量标准经过多次的提高，质控指标设置相对完整，鉴别项包括酒大黄、茯苓、甘草、黄芩和炒槟榔显微鉴别，木香、酒大黄和防风的薄层色谱鉴别，检查项包括水分及丸剂通则项下规定，含量测定为本品含黄芩以黄芩苷（C21H18O11）计，小蜜丸每1 g不得少于0.90 mg，大蜜丸每丸不得少于9.0 mg；含厚朴以厚朴酚（C18H18O2）与和厚朴酚（C18H18O2）的总量计，小蜜丸每1 g不得少于0.20mg，大蜜丸每丸不得少于2.0 mg，相对于25味中药，质控指标仍然有提升空间。其中醋香附的质控指标并未设置。因此，有必要建立醋香附的质控方法，有助于完善柴胡舒肝丸的质量标准。

柴胡舒肝丸中醋香附具有疏肝解郁，理气宽中，调经止痛。其可用于肝气郁滞，胸肋胀痛等功效，归肝、脾和三焦经。中医认为肝藏血、脾统血，只有气血调和，才可起到疏肝宽中的功效，因此，醋香附为柴胡舒肝丸主要功效药味，是其临床疗效的基础保障。目前研究报道多集中在临床研究、合理用药及指纹图谱等方面的研究[2,3,4,5,6,7,8]。而针对柴胡舒肝丸中醋香附的报道较少。该品种规格包括大蜜丸和小蜜丸，本研究选择大蜜丸为研究对象，以醋香附中香附烯酮和-香附酮为目标，建立高效液相色谱法同时测定2种成分含量，为柴胡舒肝丸的质量标准完善提供一种有效的方法。

1、材料与方法

美国Aglient 1260高效液相色谱仪，赛多利斯BP211D型电子天平。香附烯酮对照品（批号:ST77690181）来自上海标准技术有限公司，-香附酮对照品（批号：110748-202117）来自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，Merch公司），乙酸乙酯（分析纯，天津科密欧）；水由Milli-Q系统制得。柴胡舒肝丸4批，来自4家企业，均为大蜜丸，批号依次为211202、20211003、210903、20211011。

2、结果与分件

2.1色谱条件

色谱柱ZORBAXSB-C18(4.6mm 250mm,5 m），以甲醇水（64:36）为流动相，流速1.0 m L/min，检测波长254 nm。理论板数按-香附酮峰计算均应不低于5 000，进样体积为5 L。

2.2对照品溶液的制备

精密称取香附烯酮10.56mg和-香附酮20.09mg，分别置20 m L和50 m L量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，再分别精密量取4 m L和2 m L，置10 m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即可。

2.3供试品溶液的制备

取供试品，大蜜丸2丸，置圆底烧瓶中，连接挥发油测定管，加入200 m L水，在挥发油测定管中加入约1 m L乙酸乙酯，连接冷凝管，加热至沸腾，保持沸腾状态1.5 h。分取乙酸乙酯层，并用适量甲醇自冷凝管端洗涤3次，合并转移置10 m L量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀即可。

2.4缺醋香附药味阴性对照溶液的制备

按照处方量称取缺醋香附药味的其他24味药，以总量100 g为基础，加入炼蜜180 g，混匀，取大约2丸的量，按照2.3项下同法制备阴性对照溶液。

2.5专属性试验

取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各5 L，注入液相色谱仪中，按照上述色谱条件进行分析，记录色谱图（图1）。阴性对照溶液在目标成分保留时间位置处无干扰，且与相邻色谱峰达到基线分离，专属性良好。

2.6线性关系考察

取对照品溶液，依次精密量取1 L、2 L、5 L、8 L和10L注入液相色谱仪中，记录色谱图，以目标成分质量为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，分别得香附烯酮和-香附酮的线性方程分别为Y=3 133.833X+9.804，2=1.000，范围0.211～2.112 g，和Y=3919.142X+0.649，2=1.000，范围0.080～0.804 g，表明线性关系良好。

2.7精密度试验

精密吸取对照品溶液5L注入液相色谱仪中，注入液相色谱仪中，按照上述色谱条件同法分析6次，记录色谱图。以香附烯酮和-香附酮峰面积计算精密度，RSD分别为0.5%和0.7%，表明仪器精密度良好。

2.8重复性试验

取同一批（批号：211202）样品2丸，按2.3项下方法操作，制成供试品溶液，同样方法处理6份，按照上述色谱条件测定，样品中含香附烯酮0.10 mg/丸，RSD为1.7%；-香附酮0.28 mg/丸，RSD为1.4%，表明该法重复性良好。

2.9稳定性试验

精密吸取重复性试验一供试品溶液，分别于0 h,2 h,4 h,6 h,8 h,12 h和24 h，在上述色谱条件下进样分析，测得香附烯酮和-香附酮峰面积的RSD分别为1.0%和0.8%，表明供试品溶液至少在24 h内稳定。

2.1 0加样回收率试验

取已知含量的同一批（批号：211202）样品1丸，等比例加入目标成分（取香附烯酮20.66 mg和-香附酮26.60 mg，分别置50 m L和20 m L量瓶中，用乙酸乙酯溶解并稀释至刻度，分别精密量取0.3m L和0.2m L）置500 m L圆底烧瓶中，按照2.3项下同法处理6份，按照上述色谱条件分析，分别计算回收率（表1），表明准确度满足要求。

2.11样品的测定

取上述4批样品各2丸，按照2.3项同法处理，平行处理3份，按照上述色谱条件测定，计算柴胡舒肝丸中香附烯酮和-香附酮的含量，见表2。

表2柴胡舒肝丸中香附烯酮和-香附酮的含量

3、讨论

柴胡疏肝丸（大蜜丸）服用量为1次1丸，一日2次。本文以日服用量为基础，选择柴胡舒肝丸日服量作为分析用量。利用醋香附中香附烯酮和-香附酮具有挥发的特性，采用水蒸气蒸馏的方式制备供试品溶液。并分别考察乙酸乙酯、二甲苯、石油醚（60～90℃）和甲苯对挥发油的接收能力，结果发现，二甲苯和甲苯在供试品溶液制备过程中，虽然有效的接受挥发油，但是存在溶剂间兼容性问题；石油醚挥发性较强，在蒸馏过程中减少明显，最后选择乙酸乙酯作为挥发油接受液。

目前报道的供试溶液的制备采用溶剂浸泡提取方式居多[7,8,9,10]，而柴胡舒肝丸中共计25味药，均以原粉入药，成分极其复杂，采用溶剂浸泡提取，检测方法不仅难以开发，而且方法专属性也不好。本文采用水蒸气蒸馏的方法，对目标成分进行了净化，提高了分析的专属性和准确度。

现阶段对香附成分的分析方法较多，香附烯酮和-香附酮的分析多采用气相色谱法[11,12,13,14,15]，而本文选择液相色谱-二极管阵列检测器分析，通过计算峰纯度和光谱图，调整色谱条件，已达到满意的分析结果和色谱峰。与气相色谱法比较，液相色谱+二极管阵列检测器方法优势明显。采用DAD检测器对二者进行光谱扫描，香附烯酮最大吸收波长为250 nm，-香附酮最大吸收波长为254 nm，结合样品中的含量高低，优选254 nm作为检测波长。并考察了Agilent 5TC-C18 (2)、ZORBAX ECLIPSE XDB-C18和Dimaonsil C18三款同规格（250 mm 4.6 mm,5 m）色谱柱，均可将二者完全分离，且与相邻色谱峰分离度大于1.5。

含量测定结果表明，不同企业间柴胡疏肝丸中香附烯酮和-香附酮含量差异较大，本研究的取样方式为整丸取样，在一定程度上反映了样品的均一性，在目前的质量标准中未作质控，本文也为类似中成药的分析方法提供新的思路。现阶段对香附研究报道认为药理活性与其挥发油成分相关[16,17,18,19]。本文建立了HPLC法对柴胡疏肝丸中香附（制）的香附烯酮和-香附酮含量测定，其结果建议以二者总量表示更为合理准确。

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