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沉默miR-135a-5p对宫颈癌细胞增殖、侵袭的影响及作用机制

2023-10-10 64 上传者：管理员

摘要：目的探究沉默微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)对人宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭的影响，重点分析miR-135a-5p在宫颈癌HeLa细胞中的作用机制。方法将宫颈癌HeLa细胞经培育后分为对照组、过表达组、沉默组，对照组不做处理，过表达组转染miR-135a-5p mimics上调载体，沉默组转染miR-135a-5p inhibitor下调载体。使用实时荧光定量法检测每组宫颈癌HeLa细胞中miR-135a-5p表达量；四甲基偶氮唑盐法检测每组宫颈癌HeLa细胞增殖水平；Transwell小室法检测每组宫颈癌HeLa细胞侵袭水平。结果与对照组比较，过表达组(24 h、48 h、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力、miR-135a-5p、宫颈癌HeLa细胞迁移数、侵袭数明显升高，宫颈癌HeLa细胞凋亡能力明显降低(P<0.05);与对照组比较，沉默组(24 h、48 h、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力、迁移数、侵袭数、miR-135a-5p明显降低，凋亡能力明显升高(P<0.05);与过表达组比较，沉默组(24 h、48 h、72 ...

关键词：
宫颈癌
宫颈癌HeLa细胞
微小RNA-135a-5
恶性肿瘤
沉默
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临床上对于宫颈癌的判断最早起源于20世纪65年代，其是女性泌尿、生殖系统常发的恶性肿瘤病症，患者罹患宫颈癌后需及时重视起来，避免病症恶化[1]。据某些研究报道[2],现当下我国宫颈癌患者基数逐年升高，因此宫颈癌成了临床妇科研究的重中之重。据某些研究认为[3],患者在宫颈癌治疗期间往往会存在不同程度适应不良等表现，可能会导致病情恶化状况发生，进而影响治疗结局。微小RNA-135a-5p(miR-135a-5p)在恶性肿瘤组织中呈高度表达，尤以宫颈癌最为明显[4]。据某些研究报道[5],miR-135a-5p是结构高度保守的蛋白质，在测验宫颈癌过程中起到至关重要的作用，其亦可用来表达严重程度、TNM分期、肿瘤转移状况等宫颈癌临床特征。本研究探讨沉默miR-135a-5p对患者机体病灶组织内宫颈癌细胞增殖影响、侵袭效率，并研究其主要作用机制。

1、对象与方法

1.1材料

人宫颈癌HeLa细胞(购自上海信裕生物科技有限公司，货号：HeLa,品牌：ATCC),本研究过程经医院伦理委员会批准。RPMI 1640由(北京伊塔生物科技有限公司提供，货号：YT8432;胎牛血清由广州蕊特生物科技有限公司提供，货号：S8056-00/01/05;miR-144基因由杭州开泰生物技术有限公司提供，货号：CD201-0011;Trizol试剂由武汉纯度生物科技有限公司提供，货号：CD-102523GM;磷酸盐缓冲液(PBS)由上海广锐生物科技有限公司提供，货号：PR694;磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抗体由深圳豪地华拓生物科技有限公司提供，货号：PL0402037;蛋白激酶B(AKT)抗体由沈阳万类生物科技有限公司提供，货号：WL0003b。

1.2宫颈癌HeLa细胞培育和分组

先用双抗的RPMI1640、13%胎牛血清完全培养基，保存温度为38℃培养已购买的人宫颈癌HeLa细胞，每隔4 d替换新鲜培养液，当细胞融合度达到73%以上时，开始传代培养。选择人宫颈癌HeLa细胞，将其分为对照组、过表达组、沉默组。

1.3 miR-135a-5p转染实验

对照组不做处理，过表达组转染miR-135a-5p mimics上调载体，沉默组转染miR-135a-5p inhibitor下调载体。miR-135a-5p mimics序列：上游引物5′-CAUUGCACUUGUCUCGGUCUGA-3′,下游5′-AGACCGAGACAAGUGCAAUGUU-3′;miR-135a-5p inhibitor序列：上游引物5′-UAUUGCACUCGUCCCGGCCUCC-3′,下游5′-AGGCCGGGACGAGUGCAAUAUU-3′,在转染过程中，每组培养基浓度均保持在120 nmol/L。

1.4荧光定量聚合酶链反应(PCR)实验

于11时取出培育好的宫颈癌HeLa细胞样本，实时RT-PCR法检验miR-135a-5p指标。选取转染72 h对照组、过表达组、沉默组miR-135a-5p细胞，并用Trizol试剂提取，将采集到的总核糖核酸经逆转录合成cDNA,配制反应体系可选用各组2μl的核糖核酸样本，0.78μl、1.23μl、4.56μl、0.27μl的RT、dNTPs、5 ml缓冲液、逆转录酶(MMLV),保持15℃下，35 min。组建RT-PCR体系，其中包含1.33μl、7.67μl、1.2μl、0.10 ml的无核酸酶水、cDNA、引物、探针混合物及通用混合物，小核RNA为内部。其中，miR-135a-5p序列：上游引物5′-GGGCGGAATTGCACTTGTC-3′,下游5′-CTCAACTGGTGGTGTCGT GGAGTC-3′,反应25 min,保持温度在75℃,接着50℃下反应10 min,循环40次，记录数值，即为miR-135a-5p表达量。

1.5四甲基偶氮唑盐(MTT)实验

宫颈癌HeLa细胞增殖能力检测使用MTT法：将每个组胰酶进行分解，形成单细胞悬液，离心5 min,丢弃上清液，使用5℃的洗液，洗涤2次。取配制的单细胞悬液，加0.23 ml、0.50 ml的MTT、70%乙醇，在-24℃下固定，并在5℃下放置12 h,离心9 min,洗液洗涤3次，放于无光环境下，取用碘化丙啶液染色，用SpectraMax Paradigm卡盒式多功能酶标仪(美谷分子仪器有限公司上海)检测OD值，计算增殖能力指数。用Agilent NovoCyte流式细胞仪(安捷伦科技公司美国)检测宫颈癌HeLa细胞的凋亡能力。

1.6划痕实验

划痕实验用来检验宫颈癌HeLa细胞迁移能力，选宫颈癌HeLa细胞用胰蛋白酶分解，获取细胞悬液接种至6孔板上，并用0.014 ml移液器枪头将全部单层细胞从上至下画一条划痕，用PBS洗涤刮下细胞，向干净培养基中加4 ml溶液，37℃下培育29 h,弃去培养液，显微镜下观察并记录视野平均值，重复3次，取细胞迁移数平均值。

1.7 Transwell小室实验

使用Transwell小室检验各组宫颈癌HeLa细胞侵袭能力指数，于15时将培养板置于Transwell小室，下室加120 ng/ml反应溶液、上室加细胞液，静放2 d,用三羟甲基丙烷溶液对培养板进行处理，PBS洗5次，每次洗5 min,固定并用苏木素染色，洗涤后，在显微镜下，观察上室的细胞数，记录视野内细胞数平均值，重复4次，取宫颈癌HeLa细胞侵袭数平均值。

1.8统计学处理

采用SPSS26.0软件进行F检验。

2、结果

2.1 miR-135a-5p转染效果验证

与对照组比较，过表达组miR-135a-5p指标明显升高，沉默组miR-135a-5p指标明显降低，有统计学差异(P<0.05);与过表达组比较，沉默组miR-135a-5p指标明显降低(P<0.05),说明miR-135a-5p转染成功。见表1。

2.2沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞增殖、凋亡的影响

与对照组比较，过表达组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显升高，凋亡能力明显降低，沉默组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显降低、凋亡能力明显升高(P<0.05);与过表达组比较，沉默组(24、48、72 h)宫颈癌HeLa细胞增殖能力明显降低、凋亡能力明显升高(P<0.05)。见表1、图1。

2.3沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞迁移的影响

与对照组比较，过表达组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较多，沉默组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较少(P<0.05);与过表达组比较，沉默组宫颈癌HeLa细胞迁移数明显较少(P<0.05);与对照组[(75.21±8.11)%]比较，过表达组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率[(102.67±5.43)%]明显较高，沉默组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率[(62.31±5.48)%]明显较低，与过表达组比较，沉默组宫颈癌HeLa细胞划痕愈合率明显较低(P<0.05)。见表1、图2。

2.4沉默miR-135a-5p对宫颈癌HeLa细胞侵袭的影响

与对照组比较，过表达组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较多、沉默组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较少(P<0.05);与过表达组比较，沉默组宫颈癌HeLa细胞侵袭数明显较少(P<0.05)。

3、讨论

虽然预防宫颈癌的手段技术在不断提高，宫颈癌的诊治方案也在不断改善，可其对病患造成的病痛伤害是不可逆的[6,7,8,9]。宫颈癌特点是女性宫颈出现恶性肿瘤，其早期症状不明显，随着肿瘤增大从而引发并发症，进而影响宫颈癌病情。据某些研究报道[10,11],宫颈癌通过血液循环扩散至患者机体其他脏器，进而加重病情，产生其他脏器并发症。据某些研究认为[12],罹患宫颈癌与多种因素共同作用相关。

据某些研究报道[13,14,15],miR-135a-5p在宫颈癌HeLa细胞中是一种多功能基因蛋白，在肿瘤治疗抵抗中具有重要警示作用，miR-135a-5p又包含多个子蛋白因子，其具有两个相对独立的功能域：N端的redox功能域、C端的DNA修复功能域。miR-135a-5p其内核心基因AP核酸内切酶活性是促进宫颈癌HeLa细胞增殖不可或缺的因子，且miR-135a-5p提供宫颈癌HeLa细胞内95%AP内切酶活性，亦就是表明miR-135a-5p造成宫颈癌HeLa细胞增殖，故其在宫颈癌机体中异常表达[16,17,18]。有研究认为[19,20,21],miR-135a-5p基因可以和机体大约1/4微小RNA引起共鸣，其中miR-135a-5p在宫颈癌等病症中呈现高度异常，同时与宫颈癌HeLa细胞的出现有着密切联系。miR-135a-5p参与宫颈癌HeLa细胞增殖、侵袭过程，通过沉默miR-135a-5p亦可改变宫颈癌HeLa细胞迁移速度、侵袭效率，进而影响宫颈癌病灶组织病理反应。由此结果本研究推测，沉默miR-135a-5p可改变宫颈癌HeLa细胞基质的生物活性，此结果显示，当沉默miR-135a-5p表达量时，宫颈癌HeLa细胞的感染能力将会大幅度降低，缓解患者病情。

综上，miR-135a-5p与宫颈癌具有相关联系，检测miR-135a-5p表达对宫颈癌具有一定诊断效能，从而改变宫颈癌的治疗效率，miR-135a-5p为治疗宫颈癌提供借鉴指导，在宫颈癌治疗上值得探讨，miR-135a-5p对宫颈癌具有重要意义。

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基金资助:湖北省卫生计生委科研项目编号(WJ2019H524); 2020年度湖北陈孝平科技发展基金面上项目(宜市二医院发[2020]36号);

文章来源:王敏,罗菁,邓晶等.沉默miR-135a-5p对宫颈癌细胞增殖､侵袭的影响及作用机制[J].中国老年学杂志,2023,43(19):4799-4802.