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ICP-MS测定HTK液中微量钙含量

2024-06-04 98 上传者：管理员

摘要：目的：基于电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)，建立一种测定HTK液中微量钙元素的测试方法。方法：将HTK浓缩液使用1%的硝酸进行稀释，添加钙元素标准溶液制备成系列钙元素标准溶液，选择铟作为内标，采用标准加入法并扣除空白进行测定，并且对方法进行精密度、准确度和加标回收进行评估。结果：钙元素含量的测定在0～1.5 mg/L的范围内呈现良好的线性关系(R=0.9999,n=7)，相对误差(RE)均小于2%，日内精密度RSD均小于1%，回收率为95%～105%。结论：本研究所建立的电感耦合等离子体质谱法能够很好地测定HTK液中微量钙含量，该方法线性范围好，且具有良好的精密度和准确性，为标准完善、质量监督提供了参考依据。

关键词：
HTK液
方法优化
标准加入法
电感耦合等离子体质谱法
钙离子
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HTK液(Histidine-tryptophan-ketoglutarate solution)即组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶[1]，是目前常用脏器保存液中的一种[2]，在临床上常用于心脏移植、肾脏和肝脏等脏器的保存，并且Ku等[3]和Lee等[4]研究认为，其性能优于UW液和Celsior液且有更好的心肌保护作用；尹芳芳等[5]和陈乾坤等[6]通过计算机检索数据库进行分析比较，HTK液使用量显著高于Del Nido、液(DN液)但对心肌的保护效果相当。HTK液其主要成分为钠离子(Na+)、钾离子(K+)、镁离子(Mg2+)、钙离子(Ca2+)、甘露醇、2-酮戊二酸氢钾、盐酸组氨酸、组氨酸、色氨酸[7]。HTK液作为心脏停搏液，主要是通过抑制钙离子内流，剥夺细胞外钠离子从而消除动作电位，使心肌迅速停搏于舒张期[8],HTK液中微量钙含量，可以减少细胞外钙内流，减轻细胞内钙超载从而维持细胞膜的完整性，防止因钙离子含量过高而导致心肌损伤[9]。

由此可见，钙离子作为HTK液的微量成分，在临床使用时发挥着至关重要的作用，因此能精密准确地检测其含量显得尤为重要。据文献报道，先前测试钙元素含量的分析方法有很多，包括EDTA容量法[10]、离子色谱法[11]、原子吸收光谱法[12]、电感耦合等离子体光谱法[13]、离子选择电极法等。但都没有详细报道测定HTK液中微量钙离子的方法，常规的容量法也无法精密准确地测定其中微量钙含量，与之相比，电感耦合等离子体质谱法具有灵敏度高、测试时间短、精密度和准确度高等优点。本研究旨在建立一种电感耦合等离子体质谱法测定HTK液中微量钙离子含量，且适用于后期改良HTK液的研究以及药械结合等各个领域的微量钙离子含量测试。

1、仪器与材料

1.1仪器

电感耦合等离子体质谱仪：安捷伦科技有限公司，Agilent 7850。

冷却循环水机：深圳勒普拓仪器技术有限公司，UC30-AG。

超纯水机：上海和泰仪器有限公司，Master-Touch-DUVF。

微量移液枪：艾本德(中国)有限公司，100～1000 uL,20～100 uL。

分析天平：奥豪斯仪器(常州)有限公司，AR224CN。

超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司，KQ300D。

1.2试剂

超纯水：实验室超纯水机制得，电导率大于18.0 MΩ·cm-1。

钙元素标准品：1000 mg/L,100 m L/瓶，国家有色金属及电子材料分析测试中心。

钙元素标准品：10 mg/L,100 m L/瓶，国家有色金属及电子材料分析测试中心。

内标液：100 mg/L,100 m L/瓶，Agilent。

调谐液：1 ug/L,500 m L/瓶，Agilent。

硝酸：光谱级，金属元素杂质ppb级别，上海光谱。

氯化钠：原料药级，实联化工(江苏)有限公司、中盐云虹湖北制药股份有限公司。

氯化钾：原料药级，天津海光药业股份有限公司、河北华晨药业集团有限公司。

氯化镁(二水)：原料药级，天津海光药业股份有限公司。

甘露醇：原料药级，青岛明月海藻集团有限公司。

2-酮戊二酸氢钾：原料药级，湖北江民泰华化工有限公司。

组氨酸：原料药级，上海味之素氨基酸有限公司。

色氨酸：原料药级，天津天药药业股份有限公司。

盐酸组氨酸：原料药级，天津天药药业股份有限公司。

1.3气体

高纯氩气(钢瓶装，纯度>99.999%)、高纯氦气(钢瓶装，纯度>99.999%)。

1.4器具

烧杯、500 mL容量瓶、50 m L容量瓶、20 m L容量瓶、1000 uL移液枪枪头、200 uL移液枪枪头。

2、试验方法

2.1 ICP-MS仪器条件

碰撞池模式：He模式；He流量：4.5 mL/min；积分时间：0.3 s；样品引入时间：30 s；样品稳定时间：30 s；蠕动泵速度为0.3 rps。采集模式：质谱图；峰型：1个点；重复次数：3；扫描/重复次数：100。

2.2基体干扰及消除

ICP-MS在分析测样时的干扰主要分为质谱干扰与非质谱干扰。质谱干扰主要是同量异位素干扰、多原离子干扰和双电荷离子干扰等，非质谱干扰主要源于样品基态效应。本实验通过对样品进行多倍稀释、微波消解、内标校正以及标准加入法进行测试比较，最终选择标准加入法和内标校正法同时克服基体效应，以确保测量的准确性和重现性。

2.3溶液的配制

2.3.1钙离子测试储备液制备

使用分析天平，精密称量氯化钠4.383 g、氯化钾3.355 g、氯化镁(二水)4.066 g、盐酸组氨酸18.8665 g、色氨酸2.0425 g、甘露醇27.3255 g、2-酮戊二酸氢钾0.921 g、组氨酸14.6445 g，使用实验室二级水稀释溶解，定容至500mL容量瓶。配制成浓度为氯化钠150.0 mmol/L、氯化钾90.0 mmol/L、氯化镁(二水)40.0 mmol·L-1、盐酸组氨酸180.0 mmol·L-1、组氨酸1800.0 mmol·L-1、色氨酸20.0 mmol·L-1、甘露醇300.0 mmol·L-1、2-酮戊二酸氢钾10.0 mmol·L-1的浓缩10倍的钙离子测试储备液。溶液应澄清、透亮，现配现用，在2～8℃下密封避光保存。

2.3.2样品空白溶液

精密移取适量钙离子测试储备液于容量瓶，使用实验室二级水稀释定容，使钙离子测试储备液稀释倍数为10倍。

2.3.3标准曲线的绘制

使用移液枪，分别精密移取10.0 m L钙离子测试储备液于7个100 m L容量瓶内，再分别移取0.0 u L、20.0 uL、50.0 uL、60.0 u L、80.0 u L、100.0 u L、150.0 uL的钙元素标准品(1000 mg/L)于容量瓶内，最后使用硝酸溶液(浓度1%～5%wt)稀释定容至刻度线，摇匀。使其中最终组分浓度与HTK液保持一致，并配制成0.0 mg·L-1,0.2 mg·L-1,0.5 mg·L-1,0.6 mg·L-1,0.8 mg·L-1,1.0 mg·L-1,1.5 mg·L-1系列标准溶液。每个浓度点测试3次，取测试平均值。

2.4精密度和准确度

分别制备低、中、高三个浓度(0.5 mg·L-1、0.8 mg·L-1、1.5 mg·L-1)的质量控制样品，每个浓度样品平行制备3份，每份样品重复测试3次。通过统计学计算，使用相对误差(RE)表示该方法的准确度，相对标准偏差(RSD)表示精密度。

2.5加标回收率

分别制备钙元素标准溶液，取加标浓度分别为0.15 mg·L-1,0.30 mg·L-1,0.45 mg·L-1的样品各3份，分别测定3次，计算平均回收率。

3、结果与分析

3.1标准曲线

图1钙元素的标准曲线图

实验中分别对浓度为0.0 mg·L-1,0.2 mg·L-1,0.5 mg·L-1,0.6 mg·L-1,0.8 mg·L-1,1.0 mg·L-1,1.5 mg·L-1的系列标准溶液，按照设定的工作条件进行分析测试。以钙元素浓度(mg·L-1)为横坐标X轴，以钙与内标铟(In)的CPS比值比率为纵坐标Y轴，得到线性方程为Y=0.0224X+0.0159，钙元素在0～1.5 mg·L-1的浓度范围内线性良好，相关系数R为0.9999(见图1)。

3.2精密度与准确度

3个不同浓度的质量控制样品数据以及对应的准确度和精密度均列于表1，根据测试结果可知：3个浓度点的相对误差(RE)均小于2%，日内精密度RSD均小于1%。根据《中华人民共和国药典》(2020版)9101分析方法验证指导原则中规定待测定含量为ppm时，精密度可接受范围RSD(%)为8%[14]。目前测试结果均满足HTK液产品技术要求，测试结果良好。

表1精密度与准确度

3.3加标回收率

随机抽取同一批HTK液样品，进行加标回收实验。每个加标浓度平行测试3次，计算回收率和精密度，测试数据结果如表2所示。

表2样品中加标回收率及RSD实验数据

结果表明：按照2.1项下质谱条件分别对3个不同加标量的样品进行测试，平均回收率均在95%～105%之间，测定值的RSD%均小于1%，表明该方法适用于钙元素含量的测试。

4、讨论

目前，用于量化钙离子的方法包括容量法、离子色谱法、原子吸收光谱法等，我们分别比较了以上几种测试方法：由于浓度微量，容量法(乙二胺四乙酸滴定法)无法精确地测试出微量钙离子含量，空白对照组和测试组无明显差异；针对离子色谱法，我们使用瑞士万通离子色谱仪(规格型号：ECO IC 863)，色谱柱为Metrosep C6-100/4.0,3.2 mmol/L的硝酸溶液作为流动相，经外标法进行测试，在钙离子目标峰出现很大杂峰，通过剔除法逐一剔除HTK液组分自配HTK液溶液后进样测试，发现组氨酸和钙离子出峰时间重叠，此方法无法满足测试需求；考虑到试验仪器误差问题，我们分别针对电感耦合等离子体质谱法和电感耦合等离子体发射光谱法做了比对，电感耦合等离子体发射光谱法测试精密度为4%左右，电耦合等离子体质谱法精密度为2%左右，故最后选择电感耦合等离子体质谱仪进行测试。

同时，我们对质谱条件和测试进行了优化：(1)考虑到仪器常规测试条件是否适用于该复杂体系，我们通过在线调节监测，最终确定雾化器流量为1.10 mL/min，采样深度为8.0 mm，使测试方法的氧化物<2%，双电荷<3%。(2)内标的选择原则主要有以下三点：质量数相近原则；测试样品中无内标元素；电离电能相近原则。本次实验选择铟(In)作为内标元素，遵循电离电能相近原则，并且测试时满足内标回收率在90%～110%之间。(3)添加了内标校正后，测试中仍然存在干扰，测试结果相差偏大，其存在的干扰主要是质谱干扰和非质谱干扰。为了消除质谱干扰，我们在钙的六种同位素中40Ca(96.941%)、42Ca(0.647%)、43Ca(0.135%)、44Ca(2.086%)、46Ca(0.004%)、48Ca(0.187%)选择44Ca作为分析测试对象，并使用He气碰撞模式。为了消除非质谱干扰，主要是基体效应的影响，我们分别使用了微波消解法、样本多倍稀释、集体匹配和内标校正，微波消解和多倍稀释都无法很好地解决基体干扰，其测试偏差RSD>20%，只有基体匹配加内标校正才能使样品间重复性好，标准偏差<2%。(4)在通过剔除法逐一剔除样品组分配置HTK液样品进行测试时，我们发现无论剔除哪一组分，测试结果均占样品的中钙含量的20%～30%之间，故需要使用标准品原料按照配方配置样品空白溶液，并且测试样品时扣除空白影响。

5、结束语

本研究建立了基于标准加入法的电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)检测分析HTK液中微量钙离子的方法，相比于容量法、离子色谱法等分析测试方法，电感耦合等离子体质谱法具有精密度高、准确度好、分析时间短等优点。快速有效的检测方法是HTK液中钙离子质量控制的有效手段，有利于进一步的研究工作。本研究开发出方便、快速、高精密度分析微量钙离子含量的方法，使之更适用于HTK液及改良HTK液的研发以及药械结合等各个领域的微量钙离子含量测试。目前而言，对于心肌停跳保护液(HTK液)，国内仅一家厂家具备生产资质，且对于该产品没有相应的国家标准，该方法的建立为后续国产替代化产品的研究上市提供参考依据，为标准完善、质量监督提供了参考依据。

参考文献:

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[14]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020年版四部[M].北京:中国医药科技出版社,2020.

基金资助:中央引导地方科技发展资金项目(S2020QYCXE0004);