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山柰酚调控白细胞介素-1β诱导的软骨细胞的药理学研究

2023-12-04 105 上传者：管理员

摘要：目的研究山柰酚对白细胞介素-1β(IL-1β)诱导的软骨细胞凋亡的影响以及对前交叉韧带横断术(ACLT)介导的膝骨关节炎(KOA)模型小鼠病理进程的调控作用。方法将软骨细胞分为空白组、模型组和低、中、高剂量实验组。空白组用完全培养基正常培养，模型组用含10 ng•mL-1 IL-1β的完全培养基处理，山柰酚低、中、高实验组在模型组的基础上分别予以10、20、50μmol•L-1山柰酚处理。以甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原蛋白(CollagenⅡ)免疫荧光染色对原代细胞进行鉴定；以细胞计数法-8 (CCK-8)法检测山柰酚对软骨细胞增殖的影响；以蛋白质印迹法检测凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、剪切的胱天蛋白酶-3(cleaved caspase-3)、剪切的胱天蛋白酶-9(cleaved caspase-9)的表达情况。将C57BL/6小鼠随机分为假手术组、模型组、阳性药组、山柰酚组，模型组用ACLT法构建小鼠膝骨关节炎模型，4周后阳性药组予美洛昔康，山柰酚组予山柰酚进行灌胃治疗，假手术组及模型组予等体积0.9%NaCl灌胃，共4周。以苏木精-伊红(HE)及番红-O染色法观察各组小鼠膝关节软骨组织形态学变化；以原位末端标记(TUNEL)法检测膝关节软骨细胞凋亡率。结果甲苯胺蓝及CollagenⅡ免疫荧光鉴定结果表明所提取的细胞符合软骨细胞特征。空白组、模型组和低、中、高剂量实验组Bax蛋白表达水平分别为0.54±0.01、1.31±0.05、1.25±0.06、1.01±0.46、0.66±0.02;cleaved caspase-3蛋白表达水平分别为0.36±0.01、1.25±0.05、1.04±0.01、0.54±0.02、0.47±0.01;cleaved caspase-9蛋白表达水平分别为0.23±0.01、1.06±0.02、0.95±0.05、0.60±0.02、0.49±0.03;Bcl-2蛋白表达水平分别为0.34±0.02、0.20±0.01、0.29±0.02、0.37±0.00、0.35±0.02,山柰酚对Bax、caspase-3、caspase-9蛋白表达有明显的抑制作用，且可增加Bcl-2的表达(P<0.05)。病理检测结果显示，ACLT可成功构建KOA模型，山柰酚可显著改善其病理进程。结论山柰酚可显著抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，并可调控KOA小鼠软骨细胞凋亡，延缓其病理进程。

关键词：
凋亡
前交叉韧带切除术
山柰酚
膝骨关节炎
软骨细胞
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骨关节炎(osteoarthritis, OA)是最常见的慢性退行性关节疾病之一，常导致活动受限、残疾和精神压力，尤其是老年人[1]。虽然迄今为止骨关节炎病理学机制尚未完全阐明，但研究已证实软骨细胞凋亡导致的软骨变性是骨关节炎的主要病理特征[2]。山柰酚(Kaempferol)是一种重要的生物类黄酮，广泛存在于蔬菜、水果以及杜仲、牛膝、独活等骨科常用中药中[3]。山柰酚及其各种糖苷具有多种药理作用，已有研究表明其具有抑制软骨细胞炎症反应以及调控软骨细胞外基质降解的作用[4]。本研究旨在探讨山柰酚调控软骨细胞凋亡进而延缓膝骨关节炎(knee osteoarthritis, KOA)病理进程的潜在机制。

1、材料与方法

1材料

细胞原代细胞来自SPF级C57BL/6乳鼠膝关节软骨组织，人工提取培养。

动物乳鼠，购自南京市江宁区青龙山动物繁殖场，动物生产许可证号：SCXK(浙)2019-0002。3月龄SPF级C57BL/6小鼠，雌雄各半，体质量(20±3)g,均购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)20210006。实验经南京中医药大学动物实验委员会批准(伦理批号：201904A009)。

药品与试剂山柰酚，规格：每瓶20 mg,纯度：≥98%,批号：SK8030,购自北京索莱宝科技有限公司。细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8),购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；剪切的胱天蛋白酶-3(cleaved cysteine aspartate proteinase 3,cleaved caspase-3)抗体、B细胞淋巴瘤-2(B cell lymphoma 2,Bcl-2)抗体、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein, Bax)抗体，均购自英国Abcam公司；剪切的胱天蛋白酶-9(cleaved cysteine aspartate proteinase 9,cleaved caspase-9)抗体，购自美国CST公司；Ⅱ型胶原抗体(anti-typeⅡcollagen, anti-COL-Ⅱ),购自北京博奥森生物技术有限公司；苏木素-伊红(hematoxylin-eosin, HE)染液、原位末端标记(terminal-deoxynucleoitidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)试剂盒，均购自江苏凯基生物技术股份有限公司；番红-O(safranin-O,S-O),购自美国Sigma公司；白细胞介素-1β(interleukin1β,IL-1β),购自美国Protentech公司。

仪器BX43生物荧光倒置显微镜，日本Olympus公司产品；5200CE全自动化学发光图像分析系统，中国Tanon公司产品；Nano-300微量分光光度计，山东莱索公司产品；VS200数字病理切片扫描仪，日本Olympus公司产品。

2实验方法

2.1小鼠原代软骨细胞的提取与培养[5]5]

动物于南京中医药大学动物实验中心SPF级条件常规饲养，12 h/12 h光暗交替，恒温恒湿。超净台内提取小鼠双侧膝关节组织，采用手术刀片刮取股骨远端及胫骨平台表面的软骨组织于培养皿中[已加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution, PBS)],显微剪将刮取下的软骨片组织剪碎后移入离心管内，1%Ⅱ型胶原酶消化4～6 h,加入含等量10%胎牛血清的DMEM/F12培养基终止消化，以1 000 r·min-1离心5 min后吸弃上层废液，加入完全培养基2 mL重悬，接种于10 cm培养皿中，24 h后观察可见细胞贴壁生长。每隔2 d进行换液，待细胞生长至覆盖培养皿底部90%时按照1∶2的比例进行传代，取第3代细胞进行后续实验。

2.2小鼠原代软骨细胞的鉴定

2.2.1以甲苯胺蓝染色法鉴定软骨细胞[6]6]

取原代软骨细胞，吸弃皿内培养基，PBS浸洗皿底1min,重复2次；在培养皿内加入甲苯胺蓝染色液2 mL,染色5 min;再向皿内加入蒸馏水2 mL,吹打混匀后静置15 min;蒸馏水清洗2次，洗涤后在皿内加入蒸馏水1 mL混匀后，镜下观察。

2.2.2以免疫荧光染色法检测COLⅡ[6]6]

取第3代软骨细胞，重悬后以0.5×105 cell·mL-1的密度接种于6孔板；细胞贴壁后观察细胞状态，待细胞生长融合至80%左右时，吸弃培养基，PBS洗3次；室温下4%多聚甲醛固定；每孔加入0.1%Triton-X-100溶液500μL透膜10 min;含1% BSA的PBST溶液室温封闭30 min后加入一抗COLⅡ(1∶500);4℃孵育过夜，加入荧光二抗(1∶500)室温避光孵育1 h;再加入DAPI染核5 min, PBS漂洗后于荧光显微镜下观察其表达情况，随机选取3个视野进行拍照。

2.3以CCK-8法筛选山柰酚浓度[4]4]

细胞以每孔0.5×104个的密度将第3代软骨细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后，用0、5、10、20、50、100μmol·L-1的山柰酚分别处理细胞24、48和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10μL,于细胞培养箱中孵育2 h后，酶标仪于450 nm波长检测光密度值。每组设3个复孔，实验重复3次，细胞增殖率=(实验组-空白组)/(对照组-空白组)。筛选可促进软骨细胞增殖的山柰酚浓度作为后续实验给药浓度。

2.4软骨细胞的分组与干预[7]7]

将软骨细胞以每孔5×104个的密度接种于6孔板中，分为空白组、模型组和低、中、高剂量实验组，进行后续研究。空白组不作任何处理，加入完培正常培养；模型组采用含10 ng·mL-1 IL-1β的完全培养基处理，构建软骨细胞炎症模型；低、中、高剂量实验组在模型组的基础上分别予以10、20、50μmol·L-1山柰酚处理。

2.5以蛋白质印迹(Western Blot)法检测凋亡相关蛋白表达[8]8]

提取各组细胞总蛋白，加入预冷的细胞裂解液150μL,吹打混匀，冰上孵育10 min后移入预冷EP管，4℃摇床振荡10 min后以1.4×104 r·min-1离心5 min,取上清液移至新的EP管中加入5×上样缓冲液(体积比4∶1),100℃煮沸10 min, -20℃保存备用。取蛋白样本进行电泳、转膜、封闭，分别按说明书加入cleaved caspase-3、cleaved caspase-9、Bax、Bcl-2和GAPDH抗体4℃振荡过夜，TBST洗膜后加入二抗室温孵育2 h, ECL显色上机，用Image J分析图像灰度值。

2.6动物模型构建及分组[9]9]

小鼠适应性饲养1周后随机分为假手术组、模型组、阳性药组、山柰酚组，每组8只。假手术组仅切开关节囊，暴露关节腔不离断前交叉韧带；模型组用前交叉韧带横断术(anterior cruciate ligament transection, ACLT)法建立KOA模型。造模4周后对小鼠进行灌胃治疗，将美洛昔康片和山柰酚分别制成0.1 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1的水溶液，按照人与小鼠体表面积换算法确定小鼠给药剂量，阳性药组灌胃1 mg·kg-1·d-1美洛昔康，山柰酚组灌胃以5 mg·kg-1·d-1山柰酚，每只小鼠的灌胃体量为0.1 mL/10 g,假手术组、模型组均予以等体积0.9%NaCl灌胃对照，每天1次，持续4周。

2.7以HE染色和S-O染色检测软骨组织形态学变化[10]10]

取小鼠膝关节组织置于通用型组织固定液中固定24 h,脱钙液脱钙8周，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，石蜡包埋后切片进行HE染色和S-O染色。在光镜下观察膝关节软骨退变程度并进行改良Mankin’s评分。

2.8以TUNEL染色法观察KOA小鼠软骨细胞凋亡率[11]11]

将各组软骨组织用多聚甲醛固定，制备石蜡切片。加1%的Triton-100,室温放置15 min,加10×Proteinase K 10μL,37℃反应15～20 min,用PBS清洗3次。按照TUNEL试剂盒说明书操作进行细胞凋亡检测。结果判定方法：切片中软骨细胞细胞核内棕黄色颗粒者为阳性细胞。凋亡率=凋亡细胞数/细胞总数×100%。

3统计学处理

用SPSS 25.0对实验数据进行统计分析。计量资料用x¯±s表示，2组间比较用t检验，多组间比较用单因素方差分析。

2、结果

1小鼠原代软骨细胞形态观察与鉴定

如图1A显示，正常软骨细胞呈铺路石状排列，状态良好；图1B、1C为甲苯胺蓝染色，可见细胞核呈深蓝色，细胞质颜色稍浅，核仁清晰可见。荧光显微镜下观察观察可见经Ⅱ型胶原染色和DAPI复染后，细胞核呈蓝色，胞质呈清晰绿色，表明细胞质中的Ⅱ型胶原表达呈阳性，见图1D、1E、1F,表明所提取的细胞符合软骨细胞特征。

2山柰酚对软骨细胞活性的影响

结果显示，干预24 h后，除5μmol·L-1的山柰酚，其余浓度均表现出促增殖作用，与0μmol·L-1山柰酚组比较差异有统计学意义(均P<0.05);干预48 h及72 h后，各浓度山柰酚均表现出明显的细胞毒性，抑制了细胞活性，故后续实验采用10、20、50μmol·L-1的山柰酚作为低、中、高剂量实验组，干预24 h,进行进一步实验。

图1小鼠原代软骨细胞的形态及鉴定

表1细胞计数法-8(CCK-8)法检测各组细胞增殖率(x¯±s)

3山柰酚对软骨细胞凋亡相关蛋白表达的影响

空白组不作任何处理，加入完培正常培养；模型组采用含10 ng·mL-1 IL-1β的完全培养基处理，构建软骨细胞炎症模型；低、中、高剂量实验组在模型组的基础上分别予以10、20、50μmol·L-1山柰酚处理。

如表2所示，与空白组相比，模型组Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9蛋白表达显著增加，Bcl-2蛋白表达明显降低(均P<0.05),表明IL-1β可成功诱导软骨细胞的凋亡。与模型组相比，山柰酚对IL-1β诱导的软骨细胞Bax、caspase-3、caspase-9凋亡相关蛋白的表达有明显的抑制作用(均P<0.05),并呈现浓度依赖性。低、中、高剂量实验组Bcl-2的表达均明显增加，以20μmol·L-1的作用最为显著，差异均有统计学意义(均P<0.05)。

表2各组细胞凋亡相关蛋白的表达情况(x¯±s)

4山柰酚对KOA小鼠软骨组织病理形态的影响

假手术组、模型组、阳性药组、山柰酚组膝关节软骨组织改良Mankins评分分别为0.67±0.47、11.33±0.47、3.00±0.82、4.00±0.82,模型组、阳性药组、山柰酚组与假手术组比较，阳性药组、山柰酚组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。与假手术组相比，模型组的关节软骨表面破坏明显，软骨细胞减少，蛋白多糖丢失。而山柰酚组与阳性药组软骨破坏显著改善，表明山柰酚能够有限延缓KOA小鼠骨关节炎病理进程。

5山奈酚对KOA小鼠膝关节软骨组织凋亡的调控作用

假手术组、模型组、阳性药组、山柰酚组凋亡率分别为(8.81±0.81)%、(39.49±0.96)%、(16.92±0.42)%、(11.81±0.37)%,模型组、阳性药组、山柰酚组与假手术组比较，阳性药组、山柰酚组与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。TUNEL染色显示，模型组的凋亡率显著高于假手术组(P<0.05),且局部软骨组织较薄，破坏明显，细胞显著减少。阳性药组与山柰酚组细胞凋亡率显著下降(P<0.05),表明山柰酚可以抑制KOA小鼠膝关节软骨细胞的凋亡。

3、讨论

OA是一种年龄相关性疾病，会导致身体残疾并影响生活质量，影响全球约3.3%～3.6%的人口[12]。课题组前期研究表明中药复方温经通络汤可从多靶点调控KOA[9,13],本研究结果显示，山柰酚可显著改善ACLT手术诱导的KOA小鼠软骨退变程度。TUNEL染色结果显示，山柰酚可降低模型组小鼠软骨细胞的凋亡程度。

本研究结果显示模型组软骨细胞中Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达显著升高而Bcl-2表达下降，表明IL-1β干预可成功构建小鼠OA细胞凋亡模型。研究还显示，山柰酚可显著降低模型组细胞凋亡指标Bax、cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达水平，并提高抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，表明山柰酚可在体外成功缓解IL-1β诱导的软骨细胞凋亡程度。

山柰酚可显著降低IL-1β诱导的软骨细胞凋亡，同时可显著改善ACLT介导的膝骨关节炎模型小鼠软骨细胞凋亡，进而延缓其病理进程。

参考文献:

[3]米倚林,易南星,许晓彤,等.山奈酚抑制软骨凋亡延缓小鼠膝骨关节炎的实验研究[J].海南医学院学报,2022,28(17):1299-1306.

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[9]许炜民,钱佳佳,韩龙,等.温经通络汤对小鼠膝骨关节炎软骨形态改变和VEGF､MMP-13､HIF-1α表达情况的影响[J].中医药信息,2020,37(6):6-12.

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[12]梁威,李鹏,徐乾,等.罗哌卡因对白细胞介素-1β诱导的软骨细胞损伤的保护作用探究[J].中国临床药理学杂志,2022,38(15):1805-1809.

[13]许奇,钱佳佳,许炜民,等.温经通络汤对膝骨关节炎模型小鼠VEGF/VEGFR2/ERK1/2信号通路的影响[J].中国实验方剂学杂志,2021,27(13):28-34.

基金资助:国家自然科学基金面上基金资助项目(81774341);江苏省教育厅自然科学研究面上基金资助项目(20KJB360004);江苏省高校品牌专业建设二期基金资助项目;

文章来源:钱佳佳,许奇,许炜民等.山柰酚调控白细胞介素-1β诱导的软骨细胞的药理学研究[J].中国临床药理学杂志,2023,39(22):3311-3315.