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藤茶植物饮料指纹图谱建立及主要成分含量测定

2024-09-21 81 上传者：管理员

摘要：目的建立藤茶植物饮料的高效液相色谱指纹图谱分析方法。方法采用HPLC法对10批藤茶植物饮料样品进行分析，通过色谱峰指认，结合相似度评价、主成分分析探讨不同批次间的稳定性，并同时测定了藤茶植物饮料中二氢杨梅素、杨梅苷和杨梅素的含量。结果建立了藤茶植物饮料的HPLC指纹图谱，标定了10个共有峰，并指认了3个峰，10批样品的相似度均大于0.9。聚类分析和主成分分析将10批样品分为两类。结论该指纹图谱分析方法可信度高、稳定，可用于藤茶指纹图谱的质量控制及含量测定。

关键词：
含量测定
指纹图谱
藤茶
藤茶植物饮料
高效液相色谱法
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藤茶植物饮料由藤茶、枳椇子、刺梨、山楂、生姜等药食两用中药提取制成，具有解酒保肝功能，是药食两用的临床经验方。笔者在前期研究中建立了其质量标准，包括感官、鉴别、理化指标、微生物限度及主要功效成分的含量测定等。但本品为中药复方制剂，仅以单个或多个成分的定量作为其内在质量控制指标难以全面反映该产品的有效性和整体性[1]。指纹图谱能反映中药及其制剂内在化学成分信息的数据和变量[2]，具有整体性，是国际公认的中药及天然药物质量控制的有效手段[3]。中药指纹图谱信息可利用化学模式识别进行多维度的综合分析，实现数据降维、分类、识别等功能，被广泛应用于中药及中药制剂的质量控制研究[4-6]。将模式识别与色谱指纹图谱相结合，建立中药指纹图谱的化学模式识别系统，对中药的质量控制具有重要意义。

因此，本研究采用高效液相色谱(HPLC)法建立藤茶植物饮料的指纹图谱，并结合聚类分析、主成分分析等化学模式识别方法对所得色谱指纹图谱进行分析，以期为全面控制藤茶植物饮料的质量以及批次间的稳定性考察提供方法。

1、材料

高效液相色谱仪(LC-2030C Plus，岛津马来西亚工厂)，十万分之一电子天平(CPA225D，赛多利斯科学仪器有限公司)，对照品二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷(批号分别为B20372、B21458、B21457，含量均为98.0%，上海源叶生物科技有限公司)；藤茶植物饮料(本元大健康科技产业有限公司，批号分别为2023001、2023002、2023003、2023004、2023005、2023006、2023007、2023008、2023009、2023010，记为S1～S10)。无水乙醇(成都海兴化工试剂厂)；乙腈(天津市科密欧化学试剂有限公司)；甲醇(美国Sigma-Aldrich公司)；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2、方法与结果

2.1色谱条件[7]

色谱柱：ZORBAX E处理配色Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)；流动相：甲醇(A)-0.01%甲酸水溶液(B)；梯度洗脱(0～30 min，10%～18%A；30～70 min，18%～30%A；70～90 min，30%～40%A；90～100 min，40%～10%A；100～120 min，10%A)；检测波长：二氢杨梅素292 nm，杨梅苷258 nm，杨梅素369 nm；柱温：30℃；流速：0.8 mL·min-1；进样量：10 µL。

2.2溶液的制备

2.2.1对照品溶液的制备

分别精密称取二氢杨梅素32.49 mg、杨梅素8.18 mg、杨梅苷1.63 mg置10 mL量瓶中，加0.1%甲酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液的制备

精密量取藤茶植物饮料400 µL置5 mL量瓶中，加入0.1%甲酸-甲醇溶液定容至刻度，2000 r·min-1离心5 min后取上清液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1精密度试验

取藤茶植物饮料(批号：2023002)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6针，以二氢杨梅素峰(2号峰)为参照峰S，测得各共有峰的相对保留时间RSD在0.09%～0.31%，相对峰面积RSD在0.45%～1.8%，说明该方法精密度良好。

2.3.2重复性考察

取同一批藤茶植物饮料(编号：S2)6份，按“2.2.2”项下方法制备，进样分析，以二氢杨梅素峰(2号峰)为参照峰S，测得各共有峰的相对保留时间RSD在0.12%～0.55%，相对峰面积RSD在0.29%～2.4%，说明该方法重复性良好。

2.3.3稳定性试验

取同一批(编号：S2)供试品溶液，在0、2、4、8、12、24 h时进样分析，以二氢杨梅素峰(2号峰)为参照峰S，测得共有峰的相对保留时间RSD在0.09%～0.68%，相对峰面积RSD在0.68%～2.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4指纹图谱的建立与分析

2.4.1指纹图谱的建立

取10批次藤茶植物饮料，按“2.2.2”项下方法制备，进样测定，记录共有峰的峰面积和保留时间。将10批次样品的HPLC图谱导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012 A版)》软件，选择S1为参照图谱，进行多点校正和峰匹配，结果共标识出10个共有峰(见图1)，并生成藤茶植物饮料对照指纹图谱R。通过与对照品(见图2)对比，对其中3个指纹峰进行指认，确认2号峰为二氢杨梅素峰，7号峰杨梅苷峰，9号峰为杨梅素峰。其中2号峰(二氢杨梅素)为藤茶的主要有效成分，且峰较稳定，故选择其为参照物峰(S)，各共有峰的保留时间和峰面积见表1。

图1 10批藤茶植物饮料指纹图谱叠加图

图2混合对照品色图谱

2.二氢杨梅素(dihydromyricetin)；7.杨梅苷(yangmei glycoside)；9.杨梅素(yangmeiin)

2.4.2相似度评价

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012A版)软件》计算10批次藤茶植物饮料指纹图谱与对照指纹图谱的相似度，结果见表2，10批藤茶植物饮料指纹图谱相似度均在0.9以上，表明指纹图谱整体相似度较高。

2.4.3聚类分析

表210批藤茶植物饮料相似度评价结果

将10批藤茶植物饮料供试品的各色谱峰峰面积导入SIMCA 14.1软件中，通过聚类分析可以得到图3。10批次藤茶植物饮料被分为两类，S7～S10为第一类，S1～S6为第二类。

图3 10批藤茶植物饮料样本聚类分析图

2.4.4主成分分析

以藤茶植物饮料指纹图谱10个共有峰的峰面积为变量，导入SIMCA 14.1软件，进行主成分分析，共生成两个主成分，累计贡献率为93.8%，Q2为0.896，证明模型有效，并生成主成分分析得分图，见图4。结果显示，10批藤茶植物饮料基本可以分为两类，其中S1～S6为一类，S7～S10归为第二类，与聚类分析的结果基本一致。

2.5 3种指标性成分含量测定

2.5.1精密度考察

精密吸取藤茶植物饮料(编号：S2)，按“2.2.2”项下方法制备，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，计算二氢杨梅素、杨梅苷、杨梅素的色谱峰面积，RSD分别为0.45%、0.96%、0.88%，表明该方法精密度良好。

2.5.2线性关系考察

表110批藤茶植物饮料的峰面积及保留时间

图4 10批藤茶植物饮料PCA得分图

精密称取二氢杨梅素32.84 mg、杨梅苷8.82 mg和杨梅素对照品各9.90 mg，置于10 mL量瓶中，0.1%甲酸甲醇溶液定容至刻度，制成每1 mL含二氢杨梅素3284.0μg、杨梅苷822.0μg、杨梅素990.0μg的混合对照品储备液，再稀释成含二氢杨梅素656.8、328.4、164.2、82.1、41.1、20.5μg·mL-1，杨梅苷164.4、82.2、41.1、20.6、10.3、5.2μg·mL-1，杨梅素198.0、99.0、49.5、24.8、12.4、6.2μg·mL-1的系列对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱峰面积，以峰面积(y)为纵坐标，对照品浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，结果见表3。

表3藤茶植物饮料中各成分线性关系

2.5.3加样回收试验

取6份同一批次的藤茶植物饮料(编号：S2)各400μL，精密加入适量的二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷对照品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，进样分析，计算3种成分的回收率分别为99.15%、103.40%、99.76%，RSD分别为1.3%～1.8%、1.3%～2.2%、1.3%～2.0%。说明方法回收率良好。

2.5.4稳定性考察

精密吸取藤茶植物饮料(编号：S2)，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h进样测定，计算二氢杨梅素、杨梅苷和杨梅素的色谱峰面积RSD值分别为1.9%、0.90%、1.5%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.5.5样品含量测定

对10批藤茶植物饮料中的二氢杨梅素、杨梅苷和杨梅素的含量进行测定，结果见表4。10批藤茶制备的藤茶植物饮料中二氢杨梅素含量均值为1.15 mg·mL-1、杨梅苷0.22 mg·mL-1、杨梅素0.34 mg·mL-1。

表4藤茶植物饮料主要成分含量测定结果

3、讨论

藤茶植物饮料是以藤茶为主要成分研制的功能性饮料，目前，关于藤茶植物饮料的质量标准是以二氢杨梅素含量作为质量判定标准[8-9]，但中药化学成分复杂多样，有效成分难以一一明确[10]。指纹图谱技术与相似度、聚类分析、主成分分析等化学模式识别手段相结合，可用于综合评价中药质量优劣，避免了以单一成分含量评价药品质量好坏的弊端[11-12]。现代研究表明，二氢杨梅素、杨梅素、杨梅苷这3种成分为藤茶植物嫩茎叶的主要活性成分[13]，具有抗炎、抗肿瘤、降血糖等药理作用[14]，因此，选用上述成分作为藤茶植物饮料质量评价的主要指标。

本研究基于HPLC指纹图谱技术，标定了藤茶植物饮料的10个共有峰，指认出其中3个共有成分，并通过相似度分析初步评价了10批不同样品的相似性。同时，本研究采用系统聚类分析和主成分分析两种模式识别方法对藤茶植物饮料的指纹图谱数据进行模式识别分析，结果显示，10批供试品溶液的分类与原料药材的产地有一定关系，其中湖北产区藤茶原料制备的样品为一类，江西产区藤茶原料制备的样品为一类。通过对10批样品3种主要活性成分含量的计算，结果显示藤茶植物饮料中的藤茶原料虽然在地域上存在差异，但是3种活性成分的含量均符合标准，其对具体药效的影响仍需进行后续谱效关系等方面的研究[15-16]。

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基金资助:省级大学生创新创业训练计划项目(No.S202113705093); 成都医学院-成都医学院第一附属中医医院临床科学研究基金项目(No.2022LHZYYB-10);

文章来源:阳晓雪,李鑫,李雨喜,等.藤茶植物饮料指纹图谱建立及主要成分含量测定[J].中南药学,2024,22(09):2420-2423.