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DNA分子鉴定和理化分析相结合对灵芝质量评价的研究与应用

2025-03-28 110 上传者：管理员

摘要：【目的】应用DNA鉴定和理化分析相结合对20批灵芝进行质量评价。【方法】对20批灵芝进行DNA提取、聚合酶链反应（PCR）扩增、纯化、测序、输入中药材DNA条形码鉴定系统，进行鉴定。再进行标志性成分含量测定。【结果】1、2、3、4、5、6、9、10、11、12、13、14、15、16、18、20号灵芝为药典赤芝品种，而7、8、17、19号灵芝为非药典赤芝品种；对16批赤芝进行含量测定，含量符合药典规定有15个品种，含量由高到低的顺序为：2、1、5、10、18、3、4、16、15、11、13、14、6、9、12号。其中20号样品低于规定，其含量为0.38%。【结论】DNA分子鉴定和理化分析相结合能快速进行灵芝真伪优劣的质量评价。

关键词：
DNA分子鉴定
形态学鉴别
灵芝
灵芝质量评价
食药用菌
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灵芝是利用最早和文化最厚重的食药用菌之一[1],其市场需求日益增长,已知灵芝种类有88种[2]､质量参差不齐,严重制约了其临床应用的广泛性和有效性｡传统的灵芝质量评价方法主要依赖于形态学鉴别,存在主观性强､易受外界干扰､难以全面反映灵芝内在品质等局限性｡DNA条形码技术是一种有效､实用的分子鉴定手段[3],能有效弥补传统鉴定方法在中药鉴定方面的不足[4]｡

本研究开展DNA分子鉴定和理化分析相结合对灵芝质量评价的研究和应用｡对20批灵芝进行DNA提取､PCR扩增､纯化､测序､输入中药材DNA条形码鉴定系统得出16批灵芝为药典品种赤芝｡同时,测定灵芝中的三萜及甾醇成分含量反映其药效成分｡将理化分析技术与DNA分子鉴定相结合,全面､客观地评价灵芝的质量,以期为灵芝的标准化生产､质量控制及临床应用提供科学依据｡现将研究结果报道如下｡

1、材料

1.1药材来源

药材灵芝于2022年7月~2023年7月分别采购自亳州药材集散中心､安国药材集散中心､山东省聊城市冠县店子镇等｡药材灵芝产地或采购地及编号信息见表1｡

表1药材灵芝产地或采购地及编号

1.2主要试剂

灵芝孢子(赤芝)(国家药品标准物质)(编号:121701-202002;ID:QXCD-AE92､ID:A9G2-2TYZ､ID:3TWS-D6H3､ID:D0S4-90SH);对照品齐墩果酸(110709-202109)(中国食品药品鉴定研究院);植物基因组DNA提取试剂盒[十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)粗提法(]上海源叶生物科技有限公司);引物序列(正向序列ITS2F碱基序列为5'-AACCATCGAGTCTTTGAACGC-3',反向序列ITS2R碱基序列为5'-CCTTGTAAGTTTCTTTTCCTCC-3')由上海瑞楚生物科技有限公司合成;DNA分子量标记物D2000[中科瑞泰生物(北京)科技有限公司];DNA凝胶回收操作所需试剂盒(山东思科捷生物技术有限公司)｡

1.3主要仪器

KQ-250DE型超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);UV-6000T型紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司);TC-96/G/H(b)型PCR扩增仪(杭州博日科技股份有限公司);JY300HE型电泳系统(北京君意东方电泳设备有限公司);WD-9413B型凝胶分析系统(北京六一生物科技有限公司)｡

2、方法

2.1性状鉴定

按照2020年版《中华人民共和国药典》[5【]性状】项下要求对20批灵芝进行鉴定｡

2.2DNA分子鉴定

2.2.1DNA提取

CTAB抽提液5mL,按1∶50的2ME∶CTAB,混匀,在60℃的水浴锅内预热｡取0.1g灵芝样品,用液氮冷却研钵,用液氮研成极细粉末,转至离心管｡离心管中加入CTAB(预热),混匀充分,置65℃水浴锅中｡向离心管中加入等量的异戊醇氯仿(异戊醇∶氯仿=1∶24)｡以11500r/min(离心半径6.143cm)离心6min,上清液回收｡转移至新的离心管中,加入1/2体积DNA沉淀液(预冷),室温放置使沉至管底｡以12000r/min(离心半径6.143cm)离心6min,上清液轻轻弃去｡在DNA沉淀物上加1mLDNA洗涤液,静置30min,以12500r/min(离心半径6.143cm)离心10min｡上清液轻轻弃去,DNA干燥,用TE50µL溶解｡将提取得到的DNA进行电泳检测,电泳结果如图1｡

图1灵芝样品的DNA电泳图

2.2.2PCR扩增

反应体系(50µL):2×PCR反应物25µL､引物ITS2F0.5µL､引物ITS2R0.5µL､模版1µL､ddH2O24µL｡反应条件:预变性95℃､10min;循环反应40次(高温变性95℃､30s;低温退火55℃､30s;适温延伸72℃､1min)｡对PCR结果进行电泳检测,电泳结果见图2~图4｡图2中扩增成功的为编号3､4､5､6､7､8､9､10､16､20､21､22(“21”为原编号11,“22”为原编号12)灵芝样品｡图3中扩增成功的为编号1､2｡图4中扩增成功的为编号13､14､15､17､18､19｡

图2灵芝样品第1次扩增图

图3灵芝样品第2次扩增图

2.2.3PCR扩增产物纯化

PCR扩增产物经电泳后,切下有目的条带凝胶(在凝胶成像分析系统仪下),利用凝胶回收试剂盒将PCR产物进行纯化｡纯化后灵芝样品电泳结果见图5｡

图4灵芝样品第3次扩增图

图5切胶凝胶系统纯化后灵芝样品电泳图

2.2.4测序

对经过纯化处理后的产物实施序列测定(委托青岛睿博兴科生物技术有限公司)[6],并将结果输入中药材DNA条形码鉴定系统｡

2.3理化分析进行标志性成分含量测定

按照2020年版《中华人民共和国药典》[5]【含量测定】项下要求对20批灵芝运用紫外可见分光光度法进行三萜及甾醇类含量测定,进行标准曲线的制备､供试品溶液的制备､测定并记录实验结果｡

3、结果

3.1性状鉴定结果

由外观性状描述,确定1､2､3､4､5､6､9､10､11､12､13､14､15､16号灵芝为《药典》规定赤芝,而7､8､17､19号灵芝不是《药典》规定的赤芝｡18､20号灵芝,仅从外观性状描述,不能准确判断是否为赤芝,结合DNA分子鉴定进行确认,并经过山东中医药大学李峰教授验证此结论｡

3.2DNA分子鉴定结果

测序得到的DNA条形码序列及输入中药材DNA条形码鉴定系统结果显示:通过对20批灵芝DNA提取､PCR扩增､PCR产物纯化及输入中药材DNA条形码鉴定系统,得出1､2､3､4､5､6､9､10､11､12､13､14､15､16､18､20号灵芝为药典赤芝品种,而7､8､17､19号灵芝不是药典赤芝品种｡

3.3理化分析标志性成分含量测定结果

灵芝样品取样量､吸光度､浓度及含量计算结果详见表2｡通过紫外可见分光光度法进行灵芝有效成分三萜及甾醇的含量测定,并以齐墩果酸计算,含量测定结果高于《药典》规定含量为0.50%的样品,由高到低的顺序为:1.30%的2号､1.28%的1号､1.15%的5号､1.07%的10号､1.03%的18号､1.03%的3号､0.95%的4号､0.91%的16号､0.89%的15号､0.86%的11号､0.82%的13号､0.80%的14号､0.71%的6号和9号､0.70%的12号｡20号样品,含量为0.38%低于《药典》含量规定｡

表2灵芝样品含量测定取样量､吸光度､浓度､含量一览表

4、讨论

4.1DNA分子鉴定能快速鉴定灵芝是否为药典赤芝品种

灵芝药材由于多种原因造成中药品种混乱､复杂现象｡灵芝DNA分子鉴定可以对性状鉴定进行验证和补充,能够快速准确判断灵芝是否为药典赤芝品种｡

4.2DNA分子鉴定和理化分析相结合

DNA分子鉴定能快速鉴定出灵芝是否为药典赤芝品种,可用于灵芝的真伪判断｡中药灵芝的标志性成分需要用理化分析方法来进行含量测定｡因此,DNA分子鉴定和理化分析相结合的方法在灵芝及其他中药真伪优劣判定及质量评价上有重要作用,值得推广｡

参考文献:

[1]何俊,吴晓蕖,罗红梅,等.云南省灵芝资源多样性及分布特征研究[C].中国食用菌协会,中国食用菌协会药用真菌委员会.第十二届药用真菌学术研讨会论文集[A].云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所,云南大学资源植物研究院,2023:9.

[2]赵继鼎,张小青.中国灵芝科真菌资源与分布[J].真菌学报,1992,11(1):55-62.

[3]韩海斌,高书晶,徐林波,等.DNA条形码技术在草地天敌昆虫分类鉴定中的应用[J].中国草地学报,2019,41(4):136-142.

[4]崔俊丽,侯林.DNA条形码技术在中药领域的应用研究进展[J].现代中药研究与实践,2024,38(1):89-94.

[5]国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:195-196.

[6]许超.枯草芽孢杆菌BIB-9的产芽孢条件优化及其对番茄生长的影响[D].泰安:山东农业大学,2019.

基金资助:山东省中医药重点科技项目(编号:Z-2022041); 聊城市重点研发计划项目(政策引导类)(编号:2022YDSF87);聊城市哲学社会科学规划“中医药文化传承发展研究”专项课题(编号:ZXKT2024343);聊城职业技术学院重点科技项目(编号:2022LZYK02,2022LZYK01);

文章来源:张庆英,董岩岩.DNA分子鉴定和理化分析相结合对灵芝质量评价的研究与应用[J].广州中医药大学学报,2025,42(04):988-991.