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不同基原枳实的多组分含量测定及差异性成分分析

2025-05-20 101 上传者：管理员

摘要：目的测定不同基原(酸橙､香橙､臭橙､脐橙､甜橙)枳实中15种成分的含量,筛选差异性成分,为枳实的质量评价提供参考｡方法采用高效液相色谱法对46批不同基原枳实中辛弗林､N-甲基酪胺､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮芸香苷､柚皮苷､橙皮苷､新橙皮苷､柚皮素､橙皮素､甜橙黄酮､川陈皮素､橘皮素､5-去甲川陈皮素､橙皮油素的含量进行测定｡色谱条件采用WatersSymmetryC18色谱柱,以乙腈-0.1%甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱;流速为1.0mL/min;柱温为40℃;检测波长为284nm;进样量为5μL｡采用聚类分析､主成分分析(PCA)､正交偏最小二乘-判别分析(OPLS-DA)法分析不同基原枳实样品间的差异,并筛选差异性成分｡结果上述15种成分在其检测质量浓度范围内线性关系均良好(r均大于0.9990),精密度､稳定性(24h)及重复性试验的RSD均小于2.00%,平均加样回收率为91.1%~103.9%(RSD均小于3.10%)｡

关键词：
含量测定
基原
多元统计分析
差异性成分
枳实
芸香科
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枳实为芸香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培变种或甜橙C.sinensisOsbeck的干燥幼果,主产于江西､湖南､湖北､重庆等地,其中江西为枳实的道地产区｡枳实味苦､辛､酸,微寒,归脾､胃经,具有破气消积､化痰散痞的功效,多用于治疗积滞内停､痞满胀痛､大便秘结､泻痢后重､胃下垂､子宫脱垂､脱肛等,其主要含有黄酮类､生物碱类等活性成分[1―4]｡枳实中黄酮类成分主要以柚皮苷､新橙皮苷为主,生物碱类成分以辛弗林为主[2―3];黄酮类成分具有抗氧化､抗炎､抗肿瘤､助消化等作用[5],生物碱类成分具有收缩外周血管､升压等作用[6―7]｡枳实变种基原(如香橙､臭橙､脐橙)较多,相关研究发现,不同基原枳实之间的化学成分含量也截然不同[8―10]｡因此,分析不同基原枳实与化学成分之间的内在关系､明确差异性成分,具有重要意义｡基于此,本研究采用高效液相色谱法建立枳实中13种黄酮类成分(5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮芸香苷､柚皮苷､橙皮苷､新橙皮苷､柚皮素､橙皮素､甜橙黄酮､川陈皮素､橘皮素､5-去甲川陈皮素､橙皮油素)和2种生物碱类成分(辛弗林､N-甲基酪胺)[11]的含量测定方法,并对46批不同基原枳实进行含量测定,同时进行多元统计分析,筛选差异性成分,以期为枳实的质量评价及基原鉴定提供参考｡

1､材料

1.1主要仪器

DIONEXUltiMate3000型高效液相色谱仪购自美国ThermoFisherScientific公司;BT25S型电子天平购自赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;ML204T型电子天平购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;Milli-QDirect16型纯水系统购自美国Millipore公司｡

1.2主要药品与试剂

辛弗林(批号110727-202110,纯度100%)､柚皮芸香苷(批号112080-202201,纯度100%)､柚皮苷(批号110722-202116,纯度93.5%)､橙皮苷(批号110721-202019,纯度95.3%)､新橙皮苷(批号111857-201804,纯度99.4%)､川陈皮素(批号112055-202102,纯度99.7%)､橘皮素(批号112054-202102,纯度99.7%)对照品均购自中国食品药品检定研究院;柚皮素(批号AF20110451,纯度98%)､橙皮素(批号AF20092151,纯度98%)､甜橙黄酮(批号AFBL0902,纯度98%)､橙皮油素(批号AFB2091,纯度98%)对照品均购自成都埃法生物科技有限公司;N-甲基酪胺(批号wkq22102703,纯度98%)､5-去甲川陈皮素(批号wkq21052610,纯度98%)对照品均购自四川省维克奇生物科技有限公司;新北美圣草苷(纯度99.9%)､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷(纯度100%)对照品均为本实验室自制;乙腈､甲酸为色谱纯,其余试剂均为分析纯,水为超纯水｡不同基原枳实样品共46批,其中样品S1~S15的基原为酸橙､S16~S25的基原为香橙､S26~S37的基原为臭橙､S38~S43的基原为脐橙､S44~S46的基原为甜橙;样品S1~S2､S5~S9､S11~S13､S16~S19､S23~24､S26~S27､S32､S34~S35､S43~S46为本课题组于2022年5月下旬至6月中旬采集,样品S3~S4､S10､S20~S22､S28~S31､S36~S42购自江西青峰药业有限公司,样品S14~S15､S25､S33购自江西宏益药业有限公司｡

2､方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

取辛弗林､N-甲基酪胺､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮芸香苷､柚皮苷､橙皮苷､新橙皮苷､柚皮素､橙皮素､甜橙黄酮､川陈皮素､橘皮素､5-去甲川陈皮素､橙皮油素对照品适量,加甲醇配制成质量浓度分别为33.1500､25.7152､10.2000､54.3456､111.7500､291.7200､86.5324､198.1638､18.5024､4.5080､12.5440､40.0000､26.1214､4.2688､18.8944μg/mL的混合对照品母液｡精密量取混合对照品母液5mL,置于20mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得混合对照品溶液｡

2.2供试品溶液的制备

取枳实样品粉末(过三号筛)1g,精密称定,加甲醇25mL,称定质量;加热回流30min,放冷,再次称定质量;用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取续滤液,即得｡

2.4方法学考察

2.4.1专属性试验

取“2.1”“2.2”项下混合对照品溶液和供试品溶液(样品编号S16)适量,按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录色谱图(图1)｡结果显示,待测各成分与其相邻峰间的分离度均大于1.5,理论板数以新橙皮苷计不低于8000,且空白溶液(甲醇)在相应位置无干扰,表明该方法的专属性较好｡

图1专属性试验结果

2.4.2线性关系考察

精密量取“2.1”项下混合对照品母液1､1､5､5mL,分别置于20､10､20､10mL容量瓶中,加甲醇稀释至刻度,即得4个质量浓度点的系列混合对照品溶液｡吸取上述系列混合对照品溶液和混合对照品母液适量,按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录色谱图｡以待测成分质量浓度为横坐标(X,µg/mL)､峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,结果见表1｡

2.4.3精密度试验

取供试品溶液(样品编号S16)适量,按“2.3”项下色谱条件连续进样6次,记录色谱图｡结果显示,15个待测成分峰面积的RSD均小于1.52%(n=6),表明仪器的精密度良好｡

表1线性关系考察结果

2.4.4稳定性试验

取供试品溶液(样品编号S16)适量,在室温下放置0､2､4､8､12､18､24h时,按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录色谱图｡结果显示,15个待测成分峰面积的RSD均小于1.98%(n=7),表明供试品溶液在室温下放置24h内稳定性良好｡

2.4.5重复性试验

取枳实样品(编号S16)6份,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录色谱图,并采用外标法计算样品中15个待测成分的含量｡结果显示,15个待测成分含量的RSD均小于1.79%(n=6),表明该方法重复性良好｡

2.4.6加样回收率试验

取枳实样品(编号S16)约0.5g,共6份,精密称定,每份以1∶1(m/m)的比例加入相应待测成分的对照品;按“2.2”项下方法制备供试品溶液,再按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录色谱图,并计算各成分的加样回收率和RSD值｡结果显示,辛弗林､N-甲基酪胺､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮芸香苷､柚皮苷､橙皮苷､新橙皮苷､柚皮素､橙皮素､甜橙黄酮､川陈皮素､橘皮素､5-去甲川陈皮素､橙皮油素的平均加样回收率分别为94.5%､91.1%､92.8%､95.3%､96.1%､98.2%､95.5%､101.6%､102.2%､96.7%､93.9%､103.9%､99.9%､98.6%､97.1%,RSD分别为1.98%､2.07%､2.12%､1.77%､1.32%､1.19%､2.03%､1.39%､3.03%､2.48%､2.00%､1.85%､1.93%､2.22%､1.23%(n=6),表明该方法的准确度较好｡

2.4.7样品含量测定

取46批枳实样品粉末(过三号筛)各1g,精密称定,按“2.2”项下方法制备供试品溶液,按“2.3”项下色谱条件进样分析,记录峰面积,再采用外标法计算各待测成分的含量｡平行测定3次,取平均值｡结果见表2｡

表246批不同基原样品中15种成分的含量测定结果

2.5枳实的多元统计分析

2.5.1聚类分析

以46批枳实样品中15种成分的含量测定结果为变量,将其导入迈维在线工具(https://cloud.metware.cn/#/home),采用组间连接方式,以Ward.D2法作为合并规则进行聚类分析｡结果(图2)显示,当平方欧氏距离为20时,46批枳实被聚为2类:样品S38~S46(即甜橙､脐橙基原枳实)聚为一类,S1~S37(即酸橙､香橙､臭橙基原枳实)聚为另一类｡

图246批枳实的聚类分析结果

2.5.2主成分分析

将46批枳实样品中15种成分的含量测定结果导入迈维在线工具(https://cloud.metware.cn/#/home),进行主成分分析(principalcomponentanalysis,PCA)｡结果(图3)显示,46批枳实样品可聚为2类,即样品S38~S46(即甜橙､脐橙基原枳实)聚为一类,S1~S37(即酸橙､香橙､臭橙基原枳实)聚为另一类,与聚类分析结果一致｡

图346批枳实样品的PCA得分图

2.5.3正交偏最小二乘-判别分析

将46批枳实中15个成分的含量测定结果导入迈维在线工具(https://cloud.metware.cn/#/home),进行正交偏最小二乘-判别分析(orthogonalpartialleastsquaresdiscriminantanalysis,OPLS-DA)｡由OPLS-DA得分图(图4)可知,46批枳实样品可聚为2类,即样品S38~S46(即甜橙､脐橙基原枳实)聚为一类,S1~S37(即酸橙､香橙､臭橙基原枳实)聚为另一类,与聚类分析､PCA结果一致｡OPLS-DA模型中,R2Y=0.966､Q2=0.943,均大于0.5,表明该模型稳定可靠｡进一步通过模型拟合分析得到变量重要性投影(variableimportanceprojection,VIP)值,以VIP值>1为标准,筛选不同基原枳实的差异性成分｡结果(图5)显示,VIP值>1的成分分别为新橙皮苷､柚皮苷､橙皮油素､新北美圣草苷､橘皮素､甜橙黄酮､橙皮苷､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷｡

图446批枳实的OPLS-DA得分图

图546批枳实的VIP得分图

以2类基原(甜橙､脐橙基原和酸橙､香橙､臭橙基原)枳实中差异性成分的含量平均值为依据,计算枳实中差异性成分的相对含量(以百分比计),并作柱状图｡结果(图6)显示,酸橙､香橙､臭橙基原枳实中5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮苷､新橙皮苷､橘皮素､橙皮油素的相对含量远高于甜橙､脐橙基原枳实,而橙皮苷､甜橙黄酮的相对含量远低于甜橙､脐橙基原枳实｡

图646批枳实中差异性成分相对含量的柱状图

3､讨论

3.1样品前处理方法的考察

本研究考察了不同提取溶剂(50%甲醇､甲醇和乙醇)､提取方式(超声和回流)以及提取时间(10､30､45min)对样品提取效果的影响｡结果发现,以甲醇为提取溶剂得到的供试品溶液的色谱信息较丰富,且响应比较均衡;加热回流的提取效果要优于超声提取,回流提取30min和45min无显著区别｡因此,本研究采用甲醇回流提取30min作为样品的提取方法｡

3.2色谱条件的选择

本研究采用二极管阵列检测器对供试品溶液进行190~400nm范围的全波长扫描,结果发现,大部分成分在284nm附近有较大的紫外吸收,响应较好,因此本研究选择284nm作为检测波长｡在流动相选择上,本研究考察了甲醇-水､甲醇-0.1%甲酸､乙腈-水､乙腈-0.1%甲酸对各成分分离效果的影响,结果显示,以乙腈-0.1%甲酸作为流动相时,各成分分离效果最佳｡

3.3多组分含量及差异性成分分析

本研究对46批枳实中15种成分的含量进行测定,并采用聚类分析､PCA､OPLS-DA对样品进行多元统计分析｡结果显示,甜橙和脐橙基原枳实聚为一类,酸橙､香橙､臭橙基原枳实聚为另一类,这提示甜橙､脐橙基原枳实与酸橙､香橙､臭橙基原枳实存在较大差异｡《中国植物志》记载:甜橙分为3大类,即普通脐橙､甜橙和血橙;臭橙和香橙为酸橙的不同栽培类型[11―12]｡由此可知,本研究结果将甜橙､脐橙基原枳实归为一类,将酸橙､香橙､臭橙基原枳实归为另一类是合理的｡进一步筛选出不同基原枳实的差异性成分为新橙皮苷､橙皮油素､柚皮苷､新北美圣草苷､橘皮素､橙皮苷､甜橙黄酮､5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷,且酸橙､香橙､臭橙基原枳实中5,7-二羟基色酮-7-新橙皮糖苷､新北美圣草苷､柚皮苷､新橙皮苷､橘皮素､橙皮油素的相对含量远高于甜橙､脐橙基原枳实,而橙皮苷､甜橙黄酮的相对含量远低于甜橙､脐橙基原枳实｡

综上所述,本研究测定了不同基原枳实中15种成分的含量,并结合多元统计分析筛选出了不同基原枳实的差异性成分,可为枳实药材的质量评价及基原鉴定提供参考｡

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