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苦杏仁基原的分子生物学鉴定

2025-06-26 60 上传者：管理员

摘要：目的为提高苦杏仁质量鉴定水平和保证苦杏仁临床用药清晰准确，文章拟建立一种能快速鉴定苦杏仁基原的分子生物学方法。方法通过比对GenBank数据库收录的西伯利亚杏（PrunussibiricaL.）和非西伯利亚杏[山杏（PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim.）、杏（PrunusarmeniacaL.）和东北杏（Prunusmandshurica(Maxim.)Koehne]的碱基序列差异，设计特异性鉴别引物ycflb，找到了一种限制性内切酶对PCR产物进行酶切消化，验证酶切结果与苦杏仁的测序基原的一致性。结果建立了西伯利亚杏和非西伯利亚杏的基原鉴定分子生物学方法，苦杏仁的ycflb引物的PCR产物经限制性内切酶PsiⅠ酶切后形成不同PCR条带类型，西伯利亚杏酶切后电泳图谱大小在约600bp处，即未被P酶切开；非西伯利亚杏（山杏、东北杏或杏）酶切后电泳图谱大小在约400bp和200bp处存在两条DNA条带。结论实验建立的分子生物学方法可准确鉴定苦杏仁基原，结合现有苦杏仁理化鉴定方法提高苦杏仁质量控制水平，同时可以准确指导苦杏仁的临床用药。

关键词：
分子生物学
基原
聚合酶链式反应
苦杏仁
限制性内切酶
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苦杏仁为蔷薇科植物山杏（PrunusarmeniacaL.var.ansuMaxim）、东北杏[Prunusmandshurica（Maxim.）Koehne]、西伯利亚杏（Prunus.sibiricaL.）或杏（PrunusarmeniacaL.）的干燥成熟种子[1]，始载于《神农本草经》[2]，具有降气止咳平喘[3]、润肠通便[4]的功效[5]。苦杏仁作为药食两用的传统中药在中药制剂[6]中被广泛使用[7]，因此对其质量控制方面须有严格要求。由于不同基原的苦杏仁[8]的外观性状肉眼观察无差别，且化学成分相似，导致苦杏仁药材在实际应用中存在多个基原物种混用的现象，因此找到一种快速鉴定苦杏仁基原的方法是迫在眉睫的。分子生物学方法是利用物种基因组内一段标准的、相对较短的DNA片段达到鉴定目的。翟英茹等[9]分析了药典中药材多基原[10]的方法，发现分子生物学方法相对于性状，显微及理化等传统鉴别方法，更具精准性和灵敏性。分子生物学方法首先提取样品中基因组DNA，找到特异引物进行聚合酶链式反应（PCR）扩增特定片段，再进行测序得到物种的碱基序列[11]，然后与数据库中已收录的物种信息[12-13]进行对比，找到其与亲属种的亲缘关系[14]，从而快速确定物种信息，具有更加准确，稳定和可靠的特点。近年来，学者们将[15-16]DNA条形码技术应用于药用植物及中成药产品鉴定，表现出较强的鉴定能力。张珂璠等[17]利用DNA条形码技术实现了中药蟾衣基原的鉴定。冯璟璐[18]采用叶绿体碱基序列对鸢尾属物种进行了分子鉴定，解决了川射干近缘种鉴定困难的问题。李冉郡[19]等利用DNA条形码技术对全产业链的大黄药材的基原进行了鉴定。罗宇琴等[20]结合DNA条形码及HPLC指纹图谱对竹茹进行鉴定，为竹茹的质量控制提供依据。

本研究依据不同基原的苦杏仁的碱基位点上的差异，设计叶绿体上基因片段ycflb引物和限制性内切酶PsiⅠ等形成的分子生物学方法对苦杏仁的基原进行鉴定，明确入药苦杏仁基原，提高苦杏仁临床用药准确性和安全性，同时有效补充苦杏仁现有理化鉴别方法，形成更精确的苦杏仁质量控制体系。

1、材料与方法

1.1试验材料

苦杏仁药材来源于市场购买。新型植物基因组DNA提取试剂盒（厂家：天根生化科技有限公司，货号：DP320，批号：A0112A）；限制性内切酶PsiⅠ（厂家：NewEnglandBiolabs，型号：R0744L）；DNA聚合酶（厂家：Genstar，货号：A033-101，批号：GD151）；primer（厂家：华大基因，货号：BJP09092001557）；MightyTA-cloningKit、A-overhangmixture（厂家：Takara，货号：6028，批号：AME0081A）。

1.2试验仪器

PCR仪（厂家：BIO-RAD，型号：S100TMThermalCycler，批号：621BR16646）；离心机（厂家：Eppendorf，型号：Centrifuge5424，批号：5424CN752191）；电泳仪（厂家：BIO-RAD，型号：Sub-cellGT，批号：041BR120741）；恒温箱（厂家：Thermo，型号：IGS60，批号：41714765）；照胶仪（厂家：BIO-RAD，型号：GelDocTMXR，批号：721BR11543）；生物安全柜（厂家：Thermo，型号：1300SERIESA2，批号：1389314040501）

1.2方法

1.2.1模板

DNA提取按新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN货号DP320）的步骤对苦杏仁基因组DNA进行提取：取已粉碎的苦杏仁干重组织20mg于离心管中，加入400μl缓冲液LP1和6μlRNaseA（10mg/mL），旋涡振荡1min，室温放置10min，加入130μl缓冲液LP2，充分混匀，旋涡振荡1min。12000rpm离心5min，转移上清至新离心管中。加入1.5倍体积的缓冲液LP3，立即充分振荡混匀15sec后加入到一个吸附柱中，12000rpm离心30sec后倒掉废液。向吸附柱中加入600μl漂洗液PW，12000rpm离心30sec，倒掉废液，重复PW漂洗一次，12000rpm离心2min，倒掉废液，室温放置数分钟，滴加50μl洗脱缓冲液TE，室温放置2min，12000rpm离心2min得苦杏仁基因组DNA，-20℃保存。

1.2.2PCR扩增及基原鉴定引物的确定

以1.2.1项下的6个苦杏仁基因组DNA为模板（编号1～6），双蒸水（ddH2O），DNA聚合酶和不同引物（表1）进行PCR扩增。扩增总体系为10μl，其中DNA聚合酶5μl，上下游引物各0.2μl，模板DNA0.3μl，灭菌去离子水4.3μl。PCR扩增程序：95℃预变性30s，循环反应30次（95℃变性2min，55℃30s，72℃延伸90s），延伸（72℃）5min，PCR产物4℃保存。上述PCR产物部分用2.0%琼脂糖凝胶进行电泳检测，分析电泳结果。

1.2.3苦杏仁样品的基原鉴定测序

纯化1.2.2项下的PCR产物进行基因克隆后，送至华大基因进行测序确定种属。

1.2.4限制性内切酶的选择

与NCBI数据库中的苦杏仁序列进行对比，分析1.2.3项下得到的碱基序列，找到西伯利亚杏和非西伯利亚杏的ycflb引物的基因序列的酶切位点（如图4），设计一种限制性内切酶PsiⅠ。

表1引物名称及其碱基序列

1.2.5苦杏仁的ycflb引物片段的酶切反应

选取10个苦杏仁ycflb引物的PCR产物（编号1～10），采用限制性内切酶PsiⅠ进行酶切，P为限制性内切酶PsiⅠ酶切产物，Marker为100bpDNALadder。设计试验总体系为10μl，其中PCR产物1μl，PsiⅠ酶0.5μl，NEBcutBuffer1μl，灭菌去离子水7.5μl，混匀后放入37℃恒温模块上静置1h，酶切产物用2.0%琼脂糖凝胶（加入核酸凝胶染色剂GelRed）进行电泳检测，分析酶切电泳结果。

2、结果

2.1苦杏仁PCR反应引物的确定

①在1.2.2项PCR条件下，引物matK-390F/matK-1326、FRITILLARIAE-1/FRITILLARIAE-2、matK-XF/matK-5R和trnH/psbA的PCR条带的电泳图如图1所示。

②在1.2.2项的PCR条件下，引物rbcl-1F/rbcl724R、ITS1/ITS4、ITS2-S2F/ITS2-S3R和matK-3F_Kim/matK-1R_Kim的电泳图如图2所示。

③在1.2.2项的PCR条件下，引物ycflb-F/ycflb-R的电泳图如图3所示。该引物的PCR条带在600bp处出现单一目的片段，并且阴性对照未出现阳性条带。

④综合图1～3的电泳结果，ycflb引物的PCR产物的条带整齐且最清晰。

2.2限制性内切酶的酶切位点

根据1.2.3的测序结果，与NCBI数据库收录的苦杏仁碱基序列对比，设计了一种区分西伯利亚杏和非西伯利亚杏的限制性内切酶，酶切位点如图4。

图3 苦杏仁基因组DNA的ycflb引物的PCR条带

图4 PsiⅠ酶的酶切位点

2.3苦杏仁的酶切电泳结果

①以1.2.5项下的苦杏仁样品为模板，在1.2.2的PCR条件下，PCR条带电泳结果如图5所示。

图5 苦杏仁样品的ycflb引物的PCR结果电泳图

②依1.2.5项下酶切条件，苦杏仁ycflb引物的PCR产物的PsiⅠ酶切结果如图6所示。

图6 苦杏仁ycflb引物的PCR产物的PsiⅠ酶切电泳图

3、讨论

含苦杏仁的中成药具有清肺化痰、益气养阴等功效，2020版《中国药典》收载的苦杏仁制剂共计90余种，大部分对苦杏仁的质量控制仅沿用了其主要成分苦杏仁苷的理化鉴定方法。为补充和完善苦杏仁的质量控制体系，明确临床入药苦杏仁基原，提供优质苦杏仁种质资源是非常必要的。

本研究通过比对西伯利亚杏和非西伯利亚杏碱基序列差异，建立了一种限制性片段长度多态性聚合酶链反应（PCR-RFLP）的分子生物学方法。

结合图1和图2，对比了matK-390F/matK1326、FRITILLARIAE-1/FRITILLARIAE-2、matKXF/matK-5R、trnH/psbA、rbcl-1F/rbcl-724R、ITS1/ITS4、ITS2-S2F/ITS2-S3R和matK-3F_Kim/matK1R_Kim等8种引物的苦杏仁基因组DNA的PCR条带图谱，结果显示，阴性对照未出现阳性条带，说明PCR体系设计正确，但PCR条带普遍存在清晰度不统一，存在漂移现象。分析原因可能是该引物对苦杏仁的基因组DNA特异性不好。

结合图3可知，苦杏仁的ycflb引物的PCR条带在600bp处出现单一特异明亮条带，条带更清晰且稳定，说明ycflb引物对苦杏仁基因组DNA的特异性高，可作为苦杏仁PCR扩增反应的特异性引物。

结合图5和图6可知，苦杏仁的ycflb引物的PCR产物的条带大小约600bp处应有单一DNA条带，即苦杏仁的目的片段。经PsiⅠ酶酶切后，西伯利亚杏PCR产物经酶切后电泳图谱大小在约600bp处，即未被P酶切开；非西伯利亚杏（山杏、东北杏或杏）PCR产物条带大小在约400bp和200bp处存在两条DNA条带，可被P酶切开。为了考察该方法的准确性，对不同产地和不同形态的苦杏仁的ycflb引物PCR扩增后按1.2.3项下测序鉴定，测序结果与酶切结果均一致。

本方法对苦杏仁中药材的质量控制水平的提高和苦杏仁临床用药的安全性的保障提供了有效验证，同时该方法可为苦杏仁多样性提供鉴别基础，为其他中药材产地及相似品种真伪鉴别提供一定参考依据。由于非西伯利亚杏种间差异较小，因此ycflb引物对其区分度不高，可继续进行探索研究。

参考文献:

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].中国医药科技出版社,2020:210-211.

[2]苗苗,孔洋洋,尤旭颖,等.《神农本草经》与经方应用之苦杏仁篇[J].山东中医药大学学报,2023,4(5):554-559.

[3]杜丽佳,于彩娜.苦杏仁之药性考证[J].中国民族民间医药,2023,32(8):46-49.

[4]孙宝迪,夏斌,俞燕露,等.基于网络药理学和分子对接技术清咳平喘颗粒治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)分子机制研究[J].药物评价研究,2023,46(10):2116-2125.

[5]吴慎威,孟鑫,韩金承,等.苦杏仁油体内降血脂作用的研究[J].粮食与饲料工业,2023,34(3):34-40.

[6]王志勇.中西医结合治疗在肺结核中的应用效果[J].中国医药指南,2024,22(1):135-137.

[7]徐博,吴翠,李卓俊,等.苦杏仁采后的现状调研和质控建议[J].西部中医药,2023,36(10):45-48.

基金资助:承德市科技局项目(202205B080);

文章来源:陈媛媛,胡春兰,任贵奇,等.苦杏仁基原的分子生物学鉴定[J].中国医药指南,2025,23(18):40-43.