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基于高通量测序技术对文冠木-4味汤混合粉末鉴定研究

2025-03-07 91 上传者：管理员

摘要：目的:建立基于高通量测序技术对文冠木-4味汤混合样品鉴定研究的鉴定方法。方法:采用高通量测序技术提取文冠木-4味汤混合粉末样品中的总DNA,对ITS2片段进行PCR扩增，利用Illumina MiSeq平台对DNA片段进行双端测序，最后采用FLASH、QIIME、GraPhlAn及MEGA 7.0软件对序列进行整理并聚类分析，鉴定混合粉末中的物种。结果:混合样品中得到高质量的ITS2序列共331 436条，最终比对到了4个物种(文冠木、诃子、秦艽和黄柏)。采用Krona软件进行群落分类学组成的交互展示秦艽序列占有效序列总量的42%、文冠木为22%,诃子为20%、黄柏为16%。结论:以ITS2作为条形码，采用高通量测序技术可以鉴定出文冠木-4味汤混合样品中的物种，也为其混合药材的鉴定提供新思路。

关键词：
ITS2
分子鉴定
文冠木-4味汤
混合粉末
高通量测序技术
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蒙药文冠木-味汤(森登-4)载于《四部医典》(后编),为“文冠木,诃子,秦艽,黄柏,对希拉乌苏热所致之症,有较好疗效｡”《四部甘露》中载有“文冠-4”之名,但药方发生了一些变化,第一是文冠木,第二是诃子,第三是黄柏,第四是秦艽｡《高世格梅林方》中提及文冠四味汤,以文冠木､诃子､秦艽及黄柏水煎,即可服用,用于治疗各类希拉乌苏病,治疗风湿､类风湿等疾病[1]｡研究发现,文冠木是蒙中药的重要组成成分,具有显著的临床应用价值｡文冠木主要化学成分为三萜､黄酮､甾体类､酚类､脂肪酸､醌类等｡现代药理研究显示,文冠木具有良好的学习记忆､抗炎､抗肿瘤､抗氧化及抗炎等功效[2-3]｡诃子含有鞣质类､多酚､三萜､黄酮､挥发油等多种成分,具有良好的抗氧化､抗菌､抗炎､镇痛等作用[4]｡秦艽的有效成分以环烯醚萜苷为主,三萜､甾体､黄酮､苯丙素类等是其有效成分[5-6],具有肝胆保护､抗氧化､抗菌､神经保护､治疗关节炎､抗肿瘤等药理活性[7-11]｡黄柏的化学成分以生物碱､苯丙素､酚苷类及脂肪酸类为主,具有抗炎､抗菌､降血压､降血糖､免疫抑制､抗类风湿等功效[12-14]｡

自Sanger等于20世纪70年代开发出双脱氧链终止法用于核酸测序以来,基因测序经过二代､三代高通量测序技术,现已进入第四代高通量测序技术｡高通量测序技术凭借规模大､通量高､速度快､成本低等显著优势[15],已成为全球主流测序技术｡高通量测序可以同时对数百万个短序列进行测序,并可以在短时间内提供丰富的遗传学信息｡陈柯等[16]基于16S核糖体RNA高通量测序技术,对9种中药饮片进行了基因序列测序,并将优化后的序列与数据库比对,对特征生物群落进行了多样性分析｡罗焜等[17]基于ITS2序列100%成功鉴定了秦艽药材及其混伪品｡本研究通过高通量测序技术对文冠木-4味汤药的混合粉末样本进行分析,利用高通量测序技术探讨物种多样性,并为混伪品的基原鉴别提供新的思路与方法｡

1、材料

1.1试材

药材为文冠木､诃子､秦艽､黄柏,详细信息见表1｡

1.2试剂

1×TAE缓冲液(来自Solarbio公司);天根植物提取试剂盒､TaqDNA聚合酶和2000bpDNAMarker(均由Takara公司提供);引物(由北京六合华大基因科技有限公司合成);ddH2O和Q5DNA聚合酶(由北京康为世纪生物科技有限公司提供);乙溴化锭(由Fluka公司供应);反应所需的buffer､GCbuffer以及dNTP(均由北京索莱宝科技有限公司生产)｡

表1文冠木-4味汤组方配比

2、方法

2.1样品中总DNA提取

从文冠木-4味汤药中分别称取5g药材,将其粉碎并彻底混合以确保均匀｡随后,从混合好的粉末中分别称取3份,每份100mg,而将混合的样品分别标记SD_1､SD_2及SD_3｡其后,再利用植物提取试剂盒,提取这3份样品中的总DNA｡

2.2PCR扩增

选取混合样本,利用宏基因组学方法,鉴定不同来源的ITS2(InternalTranscribedSpacer2)基因｡所用引物序列包含正向引物ITS2及反向引物ITS3(InternalTranscribedSpacer3),分别为5'-GCATCGATGAAGAACGCAGC-3'和5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'｡PCR扩增体系中25μL配置包含:5μL5倍反应缓冲液､5μL5倍GC缓冲液､2μLdNTP､各1μL的上游及下游引物､2μLDNA模板以及8.75μL的无菌去离子水,最后加入0.25μL的Q5DNA聚合酶｡扩增过程的参数设置为:初始变性98℃持续2min,接着进行98℃变性15s､55℃退火30s､72℃延伸30s的循环,共进行25~30个循环,最后以72℃延伸5min完成扩增｡

2.3测序文库制备

本研究利用IlluminaMiSeq平台执行成对末端测序｡通过滑动窗口技术对FASTQ格式的序列数据进行质量控制｡利用FLASH工具对初步筛选合格的序列进行成对连接｡其后,将所生成的序列准确地指派给对应的采样点,以保证序列数据的正确性｡然后,利用QIIME及UCLUST等软件,在默认设置下对序列进行整理及操作分类单元(OTU)的划分｡在此过程中,去除那些丰度较低的OTU[18]｡最后,通过UNITE[19]及NCBI数据库对序列进行比对分析,以确定每个OTU的分类学信息｡

2.4分类学信息交互与进化分析

本研究基于前期工作,利用Krona软件,对样品进行系统发育关系的动态展示｡在此基础上,采用MEGA7.0分析方法,建立邻接系统发育(NJ)树,对已发现的种类进行验证,并探索样品系统进化关系｡

3、结果与分析

3.1测序结果

对粉状混合样本的种类进行差异分析(多样性分析),结果显示,在3组独立实验中,SD_1､SD_2及SD_3分别产生了135232､148619及147414条序列,累计获得的序列总数达431265条｡排除质量存疑序列后,剩余的高质量序列共计331436条(SD_1有105668条,SD_2有115829条,SD_3有109939条)｡在所有序列中,长度为377碱基对(bp)与357碱基对(bp)的序列数量最多,分别为165908及49735条｡见图1｡

图1序列长度分布

3.2分类学组成分析

根据混合样品的操作分类单元(OTU)划分及分类学比对分析,文冠木-4味汤的3组样本共鉴定出571个OTU,涵盖了242443条序列｡各样本在不同分类层次的具体构成情况列于表1及图2中｡将其与GenBank上已知的对照序列比对,共得到189条OTU,这与文冠木-4味汤混合粉末样品的4种药材对应,这4种药材分别是文冠木､诃子､秦艽及黄柏,对应的ITS2序列共计173486条｡具体比对结果见表2｡

3.3基于Krona的分类学组成信息交互展示和系统发育树构建

基于Krona的分类学组成信息交互展示:本研究利用Krona进行了分类学的交互展示,即动态可视化样本物种注释及其丰度｡Krona图以同心圆的方式展示了从最内层的域到最外层的种,共7个分类级别,每个级别的扇区大小表示了相应分类单元的相对丰度,并附有具体数值｡此外,不同的颜色用于区分不同的物种｡粉末样品中被注释到的物种为无患子科植物文冠木､使君子科植物诃子､龙胆科植物秦艽､芸香科植物黄柏,其中分组表示为秦艽序列占有效序列总量的42%,其他依次为文冠木22%,诃子20%､黄柏16%,如图3所示｡这与混合样品中的物种实际情况相符｡在分类学组成分析中,有几个尚未确定的OTU,它们可能是微生物类群｡在此基础上,通过Krona软件建立的分类组成信息交互图形,可以很好地反映样品中物种的分布状况｡

图2OTU划分和分类地位统计

表2OTU划分和分类地位统计

图3基于Krona的分类学组成信息交互展示

3.4系统发育树

在NCBI数据库中,本研究获得了4个已知种的ITS2序列,利用MEGA7.0软件进行了邻接系统发育(NJ)树构建｡所得到的系统发育树显示出较高的可信度｡该树共有11个节点,其中5个节点的可信度达到了100%,另外还有6个节点的可信度超过了70%｡从进一步的分支能够看出,NCBI中选取鉴定出的4种物种的ITS2序列与OTU代表序列单独聚为一支,编号A1､A2､A3､A4序列与GenBank中选取的文冠木的参考序列聚为一支,编号B1､B2､B3､B4与诃子参考序列聚为一支,编号C1､C2､C3､C4与秦艽参考序列聚为一支,黄柏与编号D1､D2､D3､D4聚为一支,见图4｡系统发育分析成功验证了不同物种的身份,并揭示了它们之间的亲缘联系,这为文冠木-4汤的系统发育研究提供了参考依据｡

4、讨论

本研究采用高通量测序方法分析文冠木-4味汤的混合粉末,为混伪品的基原鉴别提供了新方法｡中药材是中医药行业的根基,药材质量是药品品质提升的关键｡传统药材鉴别方法多以性状､化学成分鉴别为主,传统药材鉴别方法常受到外界环境及生物体生长发育等因素的影响,或因药材性状表征较为单一,以及药材鉴定方法通用性不理想等原因,难以准确鉴别药材[17]｡随着高通量测序技术的快速发展,越来越多的测序技术开始应用于药材鉴定领域之中｡该技术有效解决了传统鉴定方法的局限性,极大提升了药材鉴定的准确率,解决了药材混用､替用及伪用等药材市场的流通管理问题｡

图4系统发生树构建(bootstrap1000次重复)

目前,学界运用新技术方法研究中药材的成果日益增多｡如邢艳萍等[20]采用高通量测序技术,对牛蒡子及5个伪品种粉进行全基因组测序,确定6个物种,为牛蒡子原料药质量标准控制提供了新思路｡梁欣健[21]利用ITS2基因序列对南板蓝根与其混伪品进行了鉴定,结果表明,该组合序列可以作为一种鉴别正品及仿冒品的有效方法｡崔占虎等[22]通过荧光标记引物的扩增分析,对六味地黄丸中的中药丹皮､山药､泽泻3味中药进行了精确鉴别｡因此,新技术方法对中药复方混合粉末研究及相关基础研究意义重大,能极大促进蒙医药现代化｡

测序分析显示,长度为377碱基对(bp)与357碱基对(bp)的序列数量最为丰富,分别记录为165908条和49735条,这两种长度的序列较其他序列分布多｡研究样品种类组成时发现,样品中一些种类并未得到有效鉴别,其原因很可能是因来自于该地区的微生物所致,如细菌､真菌等｡尽管通过高通量测序技术发现了这微生物,但尚未对其进行系统的分类和注释｡造成这一现象的原因有两个方面:一是ITS2引物的特异性､测序的深度;二是其携带的OTU数目极小,很容易作为背景噪声被剔除,无法进行准确分类｡在Krona的物种构成信息互动演示图中,文冠木-4味汤的物种丰度信息充分展示了混合样品中所包含的药材,该方剂中每种药材的物种均已很好地得到了鉴定｡系统发育树分析进一步验证了所比对到的各个物种,混合粉末中的序列与NCBI数据库中的参考序列完美聚为一支,其中与文冠木及秦艽的序列可以聚为一支的参考序列均各有一个,而与诃子及黄柏可聚为一支的参考序列有多条｡测序结果表明,选择4个物种的ITS2序列,均与OTU的代表性序列一致,且两者间存在较近的亲缘关系｡通过高通量测序方法鉴定出了文冠木-4味汤混合药材中的4种物种,为其混合药材鉴定及质量控制提供了新方法｡

本研究仍存局限性,样本检测数量单一,检测结果还需进一步完善｡今后,应选用不同批次药材进行比较,以丰富研究结果｡当前,检测多成分复合药物物种组成的技术手段较为缺乏,高通量测序技术则是一种有效､迅速且信息量大的鉴定方式｡这项技术不仅能满足药材鉴定的具体需求,也为确保临床用药安全提供了一种强有力的工具｡

参考文献:

[1]孟和毕力格,奥·乌力吉,王秀兰,等.蒙古族医经典名方的源流考证[J].中国中药杂志,2021,46(19):5137-5143.

[2]阿拉木斯,孟克吉日嘎拉,李建良,等.不同生长期蒙药文冠木质量分析[J].中国药学杂志,2021,56(12):997-1004.

[4]张秀娟,何丽娟,卢清,等.民族药诃子药理活性研究进展[J].中国中药杂志,2016,41(4):619-623.

[5]杨洋.大叶秦艽的化学成分､抗非酒精性脂肪肝的作用及药效物质研究[D].西安:西北大学,2019.

[6]侯妹冰.大叶秦艽水溶性成分及其抗炎活性的研究[D].北京:北京化工大学,2017.

基金资助:国家药品监督管理局中药(蒙药)质量控制重点实验开放基金项目(MDK2023034); 内蒙古自治区教育厅中(蒙)药资源开发利用集成攻关大平台项目(KYPT23004);内蒙古自治区直属高校基本科研业务费项目(GXKY22238,GXKY22138);

文章来源:敖敦格日乐,乌仁珠日哈,萨其儿,等.基于高通量测序技术对文冠木-4味汤混合粉末鉴定研究[J].亚太传统医药,2025,21(03):63-67.