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高效液相色谱法同时测定宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵的含量

2025-04-23 60 上传者：管理员

摘要：目的：建立高效液相色谱法同时测定宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵含量测定的方法。方法：采用C18色谱柱，以甲醇-0.05%磷酸水溶液为流动相，检测波长分别为280nm、250nm。结果：黄芩苷和甘草酸铵分别在15.697～502.3μg·mL-1（r=0.9997）、1.589～50.84μg·mL-1（r=0.9999）线性关系良好；方法精密度和准确性良好。结论：该方法操作简单，专属性强，可用于宁神灵颗粒的质量控制。

关键词：
HPLC
中成药
宁神灵颗粒
甘草酸铵
黄芩苷
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宁神灵颗粒是一种常用中成药,由柴胡､黄芩､大黄､半夏(制)､桂枝､甘草､龙骨､牡蛎等八味药组成,具有疏肝开郁,镇惊安神的功效[1]｡目前,我国有15家企业或上市许可持有人具有该品种的批准文号,在解郁安神类中药中有较大的市场份额[2]｡然而,现行质量标准没有含量测定项,不利于质量控制,有学者建立了宁神灵颗粒中黄芩苷或甘草酸铵的含量测定方法[3-5],但同时对上述两种成分进行质量控制的方法尚没有文献报道,本文针对两种化合物紫外最大吸收波长与极性等理化性质不同的特点,采用波长切换技术及梯度洗脱技术,建立了宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵含量的同时测定方法,该方法操作简单,专属性强,为宁神灵颗粒的质量控制及标准提升研究提供了参考依据｡

1、仪器和材料

岛津2010A高效液相色谱仪,黄芩苷对照品和甘草酸铵对照品来自中国食品药品检定研究院｡宁神灵颗粒样品购于药店｡

2、实验方法与结果

2.1色谱条件

C18柱;流速1.0mL·min-1;进样量10μL;柱温30℃｡流动相组成､洗脱程序和波长切换参数见表1｡

表1洗脱程序和波长切换参数

2.2溶液的制备

2.2.1对照品混合溶液的制备将黄芩苷(10.53mg)和甘草酸铵(10.57mg)两种对照品,用70%乙醇分别稀释20倍和100倍,定容于同一容量瓶中,混匀,微膜过滤,得V混对1,再将V混对1溶液稀释4倍,微膜过滤,得对照溶液V混对｡

2.2.2供试品溶液制备取宁神灵颗粒约1.0g,精密称定,置100mL容量瓶中,加入70%乙醇溶液70mL,超声30min,放冷,70%乙醇溶液定容,微膜过滤,得供试品溶液Ⅴ供｡

2.2.3阴性对照溶液制备由于宁神灵颗粒组方中含有制半夏,通过咨询所用样品的生产企业,所用制半夏为法半夏,故缺省黄芩､制半夏､甘草药材,按处方比例与标准中的制法制备,并按照

2.2.2方法提取,得到阴性对照溶液Ⅴ阴,备用｡

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验取Ⅴ混对､Ⅴ供､Ⅴ阴溶液,按2.1项进样分析,色谱图见图1｡

图1专属性考察色谱图

2.3.2线性关系考察取Ⅴ混对1,采用70%乙醇为溶剂二倍稀释法逐级稀释,共5次,得6种不同浓度混合对照品溶液V混对1-6按照2.1项色谱条件进样检测,以峰面积(Y)对质量浓度X(μg·mL-1)进行回归分析,结果见表2｡

表22种成分的线性关系结果成分回归方程相关系数线性范围/μg·mL-1黄芩苷Y=38740X-2609890.999915.697~502.3甘草酸铵Y=8580.6X-4169.60.99991.589~50.842.3.3精密度试验取Ⅴ混对3溶液,连续进样6次,黄芩苷峰面积为4402469､4420052､4395026､4395369､4375869､4407980,RSD=0.3%;甘草酸铵峰面积为104470､104899､104613､104679､105983､104624,RSD=0.5%,结果表明仪器精密度良好｡

2.3.4重复性试验精密称取同厂家同批号宁神灵颗粒各6份,按2.2.2项制备,并进样检测,记录黄芩苷和甘草酸铵峰面积,计算含量｡黄芩苷含量分别为5.560､5.575､5.587､5.464､5.530､5.480mg·g-1,RSD=1.0%;甘草酸铵含量分别为0.816､0.819､0.823､0.795､0.800､0.808mg·g-1,RSD=1.4%,均<2.0%,说明方法重复性好｡

2.3.5稳定性试验取供试品溶液,于0､4､8､16､24､48h,按照2.1项条件进样检测,测定黄芩苷峰面积分别为1870838､1872341､1875170､1886943､1888985､1888919,RSD=0.4%;甘草酸铵峰面积分别为65513､65284､65624､65833､65552､66430,RSD=0.6%,均<2.0%,说明样品在48h内稳定｡

2.3.6回收率试验精密称取已测定含量的宁神灵颗粒6份,每份约0.5g,精密称定,分别置于6个100mL的容量瓶中,每份加入与所含的黄芩苷和甘草酸铵等质量的对照品,按2.2.2项制备,并进样检测,计算回收率,结果表明该含量测定方法准确度良好,符合测定要求,数据见表3｡

表3加样回收试验结果

2.4样品测定与结果

取4批不同批号宁神灵颗粒,按2.2.2项制备,并进样检测,计算各供试品中黄芩苷和甘草酸铵含量,结果见表4｡

表42种成分含量测定结果

3、讨论

在色谱条件摸索过程中分别考察了等度洗脱和梯度洗脱供试品各个峰分离情况,发现梯度洗脱分离效果好,洗脱时间短;同时通过扫描紫外光谱发现黄芩苷和甘草酸铵分别在280nm和250nm处有最大吸收,故选择这两个波长进行切换检测两种化合物含量,使待测组分在高灵敏度下进行检测｡在样品测定结果中,4批样品中甘草酸铵含量相对稳定,而黄芩苷含量浮动较大,一方面可能是企业采购的黄芩质量本身就有差异,黄芩药材中黄芩苷含量受产地[6]､生长年限[7]､炮制加工[8]､黄芩苷酶降解[9-10]等因素影响较大,药材中黄芩苷含量一般在8.8%~21.1%,范围跨度较大,此外,根据《中国植物志》[11]记载,黄芩属有102种,50多个变种,相似物种较多,尤其甘肃黄芩､粘毛黄芩､川黄芩等与黄芩性状较为相似,因此不排除同科属其它物种的误用的情况;另一方面可能是不同企业在药材炮制和成药制备过程中工艺略有差异,我们通过对企业调研发现,企业采购的是原药材,按药典方法炮制成饮片后再进行提取,而且在宁神灵颗粒标准的制法中并没有明确加水煎煮所用水的体积,这就可能导致不同企业在药材炮制和成药制备过程中工艺略有差异,反观药典中黄芩药材中黄芩苷的含量不低于9.0%,这种仅单一指标含量就能达到如此之高的品种在现版药典和各地方标准中极为少见,含量越高越容易提取不完全,受提取工艺参数的影响可能越明显｡原标准并没有含量测定项,而几批样品含量检测数据的波动也提示在原标准中增设含量检测指标的必要性｡本研究所开发的方法简便,快速,专属性强､精密度高,希望能为企业建立内控标准或有关部门起草法定国家药品标准提供参考依据｡

参考文献:

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国卫生部药品标准中药成方制剂第八册[S].北京,1993:61.

[3]蔡颖欣,王颖,卢翠凤.高效液相法测定宁神灵颗粒中黄芩苷的含量[J].黑龙江医药,2010,23(02):147-149.

[4]王玫,叶春朝.HPLC法测定宁神灵颗粒中的甘草酸含量[J].黑龙江医药,2009,22(04):445-446.

[5]杨振伟,张英,屈战果.HPLC法测定宁神灵颗粒中黄芩苷的含量[J].药物分析杂志,2006,26(11):1595-1596.

[6]薛黎明,秦雪梅,张丽增.不同产地黄芩药材的黄芩苷含量测定及指纹图谱研究[J].中成药,2008,(01):10-13.

[7]张齐家,王启迪.不同生长年限黄芩中黄芩甙含量测定[J].中医药学报,1998,(05):35.

[8]韩喜桃,唐雅楠,刘子琴,等.不同加工方法的“杀酶保苷”作用及对黄芩片质量的影响[J].中华中医药杂志,2022,37(01):120-124.

[11]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志,第65卷,第2分册[M].北京:科学出版社,1977:124.

文章来源:王云龙,陈立柱,张宇.高效液相色谱法同时测定宁神灵颗粒中黄芩苷和甘草酸铵的含量[J].黑龙江医药,2025,38(02):249-251.