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超高效液相色谱-串联质谱法测定鹿角胶特征多肽含量

2025-05-07 56 上传者：管理员

摘要：目的:建立鹿角胶特征多肽含量测定方法，完善鹿角胶质量控制体系。方法:鹿角胶采用水提取法，溶液用胰蛋白酶进行酶解，利用超高效液相色谱—串联质谱联用法，在电喷雾电离正离子模式下进行多反应监测，优选鹿角胶特征肽段的m/z732.8→962.4和m/z732.8→818.3作为检测离子对，以鹿角胶特征多肽为对照，用外标法进行含量测定。结果:方法的专属性强，精密度、重复性、耐用性均符合方法验证指导原则的技术要求。在浓度19.7～1970μg·L-1范围内鹿角胶特征多肽线性关系良好，相关系数为0.9998。回收率为93.91%。结论:超高效液相色谱—串联质谱联用法可用于鹿角胶的质量控制。

关键词：
含量测定
特征多肽
益精养血
超高效液相色谱—串联质谱联用法
鹿角胶
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鹿角胶收载于《中国药典》2020年版一部,具有温补肝肾､益精养血的功效,是由鹿角加工制成的固体胶[1]｡研究表明,鹿角胶主含蛋白质,为主要物质基础之一,可达85%以上,其中又以胶原蛋白含量最高[2-3]｡近年来,胶原蛋白特征肽鉴别方法已成功用于鹿角胶等胶类的真伪鉴别,对于鹿角胶的质量控制起到了非常重要的作用｡随着研究的深入,尚有一些不足需要改进,例如《中国药典》仅收载的鹿角胶特征肽的定性鉴别方法,含量测定也仅收载了氨基酸的含量测定法,还不能真实反应鹿角胶质量｡为进一步完善鹿角胶的质量控制方法,在借鉴课题组前期研究的基础上[4],本研究尝试建立鹿角胶的特征肽定量测定方法,现报道如下｡

1、试药与仪器

鹿角胶:中国食品药品检定研究院,批号:121694-201702;龟甲胶:中国食品药品检定研究院,批号:121693-201702;阿胶:中国食品药品检定研究院,批号:121274-201904;新阿胶:中国食品药品检定研究院,批号:121745-201701;黄明胶:中国食品药品检定研究院,批号:121695-201802;驯鹿角胶､驼鹿角胶:实验室自制(自制方法参考中国药典2020年版本一部鹿角胶方法),实验用鹿角胶样品购自杭州市药店,样品信息见表1｡序列分析级胰蛋白酶:上海麦克林试剂公司,批号:C12676657;鹿角胶特征肽A(标示含量为98.42%):上海强耀生物有限公司合成;碳酸氢铵(分析纯):国药集团化学试剂有限公司;甲酸､乙腈(色谱纯):默克;纯净水为Milli-Q自制｡美国安捷伦6495B液质联用仪;瑞士梅特勒XP205电子天平;恒温超声波清洗器:浙江科器公司｡

表1样品信息表

2、方法与结果

2.1仪器条件液相条件:色谱柱:ZORBAXSBC18(2.7μm,2.1mm×100mm);流动相组成:A为0.1%甲酸,B为乙腈;按表2洗脱程序洗脱｡柱温:35℃;流速:0.3mL/min;平衡时间:3min,进样量1μL｡

表2流动相梯度洗脱程序

质谱条件:离子源为ESI+;多反应监测为采集模式;氮气作为干燥气,流速设定为14L·min-1;加热模块温度250℃;鞘气流速(N2):11L·min-1;鞘气温度:320℃;毛细管电压为4kV;碰撞气采用高纯氮;碎裂电压为166V;数据采集软件:MassHunterWorkstationSoftware(Ver.B.10.00)｡

2.2鹿角胶成分特征肽段的确认由于中国药典收载的m/z765.4特征肽段不能区分鹿角胶是由梅花鹿或马鹿熬制,还是由其他近缘鹿科动物熬制,不适合作为含量测定用特征肽段,见图1｡

图1765.4(双电荷)特征肽专属性实验色谱图

通过文献检索发现,已报道的可用于鹿角胶鉴别的特征肽序列较多[5-12],通过反复验证试验发现,SEGTAASGPP(OH)GFAGEK(m/z732.8,名称暂定为鹿角胶特征肽A),兼具专属性和耐热性的优点,可作为鹿角胶含量测定的特征离子｡参考732.8(双电荷)特征肽质谱碎片离子信号,见图2｡结合MRM实际响应值,通过研究选取质荷比(m/z)732.8(双电荷)→818.3和m/z732.8(双电荷)→962.4作为检测离子对,进一步优化碰撞能量,建立采集参数,见表3｡

表3特征离子多反应监测采集参数

图2732.8(双电荷)特征肽质谱碎片图

2.3对照品溶液制备取适量鹿角胶特征肽A对照品,精密称定,以1%NH4HCO3溶液为溶剂,制成每1mL含2μg的溶液｡

2.4供试品溶液制备取粉碎的样品约0.1g(精密称定),置适宜的容器中,精密加入1%NH4HCO3溶液50mL,超声提取(功率300W,频率45kHz)30min(超声前称定重量),室温放冷,补足失去的重量,摇匀,精密吸取上述样品溶液lmL,置5mL量瓶中,加新制备的胰蛋白酶溶液(1g/L,1%NH4HCO3溶解)1mL,用1%NH4HCO3溶液稀释至刻度,摇匀,37℃恒温酶解过夜,微孔滤膜滤过,即得｡

2.5基质效应的考察分别以未酶解样品溶液和1%NH4HCO3溶液配制外标曲线,基质效应用基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的比值来评定,获得的基质效应为91%,认为基质效应不明显,可以忽略胶类基质效应｡

2.6方法学考察

2.6.1线性关系考察鹿角胶特征肽A精密取19.64mg,置100mL量瓶中,用1%NH4HCO3溶解,并稀释至刻度,摇匀,精密量取上述对照品溶液1mL,转移到100mL容量瓶里,用1%NH4HCO3作为稀释液,稀释至刻度,摇匀,为对照品溶液｡精密量取0.1､0.2､0.4､1.0､2.0mL的对照品溶液,分别置于10mL量瓶中,加1%NH4HCO3稀释至刻度,与对照溶液一同制成标准曲线溶液｡横坐标为鹿角胶特征肽A的质量浓度(X),纵坐标为色谱峰相应面积(Y),绘制标准曲线,鹿角胶特征肽A线性方程为Y=147.52X+1943.48,R=0.9998,鹿角胶特征肽A浓度在19.7~1970μg·L-1范围内,线性关系良好｡

2.6.2仪器精密度考察精密量取“2.3”项下的对照品溶液1μL,连续进样6次,峰面积RSD为1.7%,仪器精密度良好｡

2.6.3专属性实验分别精密称取鹿角胶对照药材､阿胶对照药材､黄明胶对照药材､新阿胶对照药材､龟甲胶对照药材､自制驯鹿角胶及自制驼鹿角胶各0.1g,按照“2.4”项下方法制备,精密量取1μL进样,在上述溶液色谱图中,除鹿角胶对照药材色谱图外,其他胶类与鹿角胶特征肽A色谱图相应位置上无相应的色谱峰,认为阴性无干扰,专属性强,见图3｡

图3专属性实验色谱图

2.6.4稳定性试验精密量取“2.3”项下制备的供试品溶液1μL,分别在0､4､8､12､24h时测定,供试品鹿角胶特征肽A峰面积RSD为1.9%,表明样品在24h内保持稳定｡

2.6.5重复性试验取鹿角胶对照药材,按照“2.4”项下方法,制备样品6份,测定鹿角胶特征肽A含量RSD为2.02%,平均含量为0.196%,表明该方法的重复性良好｡

2.6.6回收率试验取样品约0.050g,精密称定,加入鹿角胶特征肽A,按照“2.4”项下方法,制备样品6份｡鹿角胶特征肽A回收率的平均值为93.91%,RSD为0.91%,测定结果见表4｡

表4回收率试验结果

2.6.7鹿角胶特征肽A热稳定性试验

精密称取鹿角胶对照药材1g,放置烧瓶中,50mL水精密加入,称定重量,电热套回流加热,保持微沸,每隔一定时间取出,室温放冷,补足减失的重量,摇匀,精密量取1mL,置10mL量瓶中,加1%NH4HCO3溶液稀释至刻度,从“精密量取lmL,置5mL量瓶中”开始,按照“2.4”项下方法制备,平行2份,连续加热32h,计算鹿角胶中特征肽A的含量变化规律,结果见图4｡表明鹿角胶连续加热8h,鹿角胶特征肽A稳定,耐热性良好,24h以后有一定降低｡表明加热不会影响鹿角胶中鹿角胶特征肽A含量的测定｡

图4鹿角胶特征肽热稳定性试验结果

2.7样品含量测定结果采用建立的方法对收集的8批鹿角胶样品进行检测,每批平行制样2份,每份进样2次,以随行外标标准曲线法计算含量,并扣除水分｡含量测定结果见表5｡

表5样品中特征肽含量测定结果

3、讨论

液质联用多肽识别技术的应用,使得胶类药材的质量状况得到根本的改善,但是由于利益的驱动,鹿角胶的质量存在一定问题,部分鹿角胶按照药典标准测定均符合规定,但按照本方法测定含量极低,因此鹿角胶含量测定方法的建立可以进一步完善鹿角胶的质量控制体系,该方法专属性､准确性､重复性均较好,可使得鹿角胶质量标准更加科学｡

鹿角胶制备需要经过多次水煎和浓缩过程,破坏了其中许多热敏感的蛋白,因此含量测定用特征肽段的选择不仅要有专属性,还需要有耐热性｡通过鹿角胶特征肽A热稳定性试验表明,鹿角胶中该肽段具有一定稳定性,正常的熬制处理过程不会影响含量,适合作为含量测定用｡

目前市售的鹿角胶有黄棕色和红棕色两种,其透明度也有一定差异,课题组排除部分含量极低的异常样品,本文选取了8批次的鹿角胶样品作为研究对象,从列入研究对象的鹿角胶样品含量结果看,不同厂家含量存在一定差异,同一厂家含量差异较少,含量在0.15%~0.24%之间,透明度高的特征肽含量相对高一点,可能与与熬制过程及辅料的添加量有一定关系,也不排除部分企业违规生产的可能性,具体原因需进一步研究｡

调研显示,主要问题是少数厂家用非药典规定来源鹿角熬胶,另外还有用非药用部位熬制掺假的情况,例如鹿皮､鹿骨等,由于同一物种基因序列一致,蛋白序列也一致,可能仅存在糖基化､羟基化等翻译后修饰的差异,如何建立更科学简便的方法进行监管,需要进一步深入研究｡

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