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用LC-MS/MS法测定人血浆中环泊酚与丙泊酚的浓度

2024-11-11 99 上传者：管理员

摘要：目的建立人血浆中环泊酚与丙泊酚浓度的测定方法，并应用于全麻择期手术患者血浆中药物浓度的检测。方法血浆样本经乙腈沉淀，Symmetry C18（4.6 mm×150.0 mm, 3.5μm）色谱柱；流动相：A相为0.01%氨水溶液(含5 mmol·L-1乙酸铵),B相为乙腈；梯度洗脱；流速：0.70 mL·min-1;内标为D6-环泊酚。用电喷雾电源，多反应监测的负离子模式。考察该方法的专属性、标准曲线和定量下限、精密度与回收率、稳定性及基质效应。结果人血浆中环泊酚质量浓度在15～2 000 ng·mL-1内呈线性关系，标准曲线方程y=1.94×10-3x+8.17×10-3;人血浆中丙泊酚质量浓度在30～4 000 ng·mL-1内呈线性关系，标准曲线方程y=3.29×10-3x+6.90×10-2。环泊酚和丙泊酚的日内和日间精密度的相对标准偏差均小于9%,绝对回收率均在90%以上，分析物的基质效应在±7%内。21例手术患者血浆中环泊酚和丙泊酚质量浓度范围分别为388.82～1 135.66 ng·mL-1和1 015.98～2 796.43 ng·mL-1。结论本方法准确高效，符合生物样本分析要求，可同时测定人血浆中环泊酚和丙泊酚的浓度，适用于临床血药浓度监测和人体药代动力学研究。

关键词：
丙泊酚
人体药代动力学
液相色谱-质谱法
环泊酚
血药浓度
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环泊酚是基于丙泊酚结构改造而成的具有立体选择性的新型短效静脉麻醉药物，其受体亲和力高于丙泊酚，是我国独立自主研发的国家Ⅰ类新药[1]。目前，环泊酚在中国被批准用于非气管插管的手术/操作中的镇静和麻醉，全身麻醉诱导和维持以及重症监护期间机械通气时的镇静[2]。相较于丙泊酚，环泊酚达到相同麻醉效果的用量更低，在安全性方面也具有独特的优势[3]。人体内麻醉药物的浓度与患者的麻醉深度、围术期的安全与康复以及麻醉并发症的发生具有重要联系[4-5]。目前已建立了多种测定人血浆中丙泊酚浓度的方法，用于该药物临床药代动力学研究和血药浓度监测[6-10]。然而，环泊酚上市时间较短，缺少其在人血浆中浓度测定方法的文献报道，是当前环泊酚人体药代动力学研究和血药浓度监测的技术难点。本研究拟建立一种可以同时测定人血浆中环泊酚和丙泊酚的液相色谱-质谱法，为临床实际需要提供技术支持。

一、材料与方法

1 药品与仪器

环泊酚注射液，规格：每支20 mL/50 mg, 批号：20230517、202300807、20230809,批准文号：国药准字H20200013,辽宁海思科制药有限公司生产；丙泊酚对照品，规格：每支300 mg, 纯度：99.9%,批号：100806-202104;丙泊酚乳状注射液，规格：每支10 mL/0.1 g, 批号：22305131、22308111,批准文号：H20010368,均由西安力邦制药有限公司生产；环泊酚对照品，规格：每瓶500 mg, 纯度：99.9%,批号：11220202,D6-环泊酚对照品(内标),纯度：99.8%,批号：cc-HSK23287-202005006-001,均由海思科制药(眉山)有限公司生产。试验用人空白血浆，由河北医科大学第二医院提供。

LC-20AD高效液相色谱仪，日本岛津公司产品；API 4000+三重四级杆质谱仪，美国AB Sciex公司产品。

2 测定方法

本研究方法学建立和生物样本检测由河北医科大学第二医院完成。

色谱条件色谱柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm, 3.5 μm);柱温：40 ℃;自动进样器温度：4 ℃。内标为D6-环泊酚。流动相：含有5 mmol乙酸铵的0.01%氨水溶液(A)-乙腈(B);流速：0.70 mL·min-1;进样量：10 μL。梯度洗脱程序：0～1.0 min, 75%→99%B;1.0～5.5 min, 99%B;5.5～6.5 min, 99%→75%B。

质谱条件电喷雾电源，用多反应监测的负离子模式。碰撞气：62 kPa; 气帘气：207 kPa; 离子源喷射电压：-4 500 V,离子源温度：500 ℃;雾化气(GS1):345 kPa; 辅助气(GS2):414 kPa。环泊酚、丙泊酚和内标D6-环泊酚的碰撞电压(collision energy, CE)分别为-28、-32和-30 V,去簇电压(declustering potential, DP)分别保持在-85、-79和-83 V,定量离子对分别为m/z203.2→175.1、m/z177.1→160.9和m/z209.3→181.3。

混合对照品溶液称取环泊酚和丙泊酚对照品适量，用50%乙腈溶液溶解定容，分别得到质量浓度为2 mg·mL-1环泊酚储备液和4 mg·mL-1丙泊酚储备液。分别取上述储备液500 μL于10 mL 量瓶中，用50%乙腈溶液稀释至刻度，得到混合对照品溶液，含环泊酚和丙泊酚的质量浓度分别为100 μg·mL-1和200 μg·mL-1,置于-40 ℃冰箱保存备用。

系列工作液和质控溶液取混合对照品溶液用50%乙腈溶液稀释得到系列工作液，其中环泊酚的质量浓度分别为0.3、0.6、1.2、2.4、5.0、10.0、20.0和40.0 μg·mL-1,丙泊酚的质量浓度分别为0.6、1.2、2.4、5.0、10.0、20.0、40.0和80.0 μg·mL-1。另配制含有0.6、5.0和32.0 μg·mL-1的环泊酚和1.2、10.0和64.0 μg·mL-1丙泊酚的低、中、高质量浓度质控溶液。

内标溶液称取D6-环泊酚对照品适量，用50%乙腈溶液稀释得到质量浓度为5 μg·mL-1的内标溶液，置于-40℃冰箱保存，备用。

血浆样品处理冷冻血浆样品自然解冻，取血浆200 μL,加入内标工作液10 μL,涡旋2 min, 加入乙腈600 μL,涡旋5 min混匀，以1.09×104r·min-1离心15 min, 取上清液进样分析。

3 方法学考察

专属性取人空白血浆，丙泊酚对照品溶液，环泊酚对照品溶液，内标对照品溶液，含丙泊酚、环泊酚和内标的模拟人血浆以及1例接受丙泊酚诱导+环泊酚维持的全麻手术患者真实血浆，分别按照“血浆样品处理”项下方法处理后进样分析。

标准曲线与定量下限精密吸取系列浓度工作液10 μL,加入人空白血浆190 μL,涡旋2 min后，配制成质量浓度分别为含有15、30、60、120、240、500、1 000和2 000 ng·mL-1的环泊酚和30、60、120、240、500、1 000、2 000和4 000 ng·mL-1模拟血浆样品。按照“血浆样品处理”项下方法处理并测定。所得数据以待测物浓度(x)为横坐标，待测物与内标峰面积的比值(y)为纵坐标，用权重系数1/x2进行最小二乘法进行线性回归，分别得到环泊酚和丙泊酚的标准曲线方程。以信噪比(signal-to-noise ratio,S/N)≥10时环泊酚和丙泊酚浓度为定量下限。

精密度与回收率分别取低、中、高质量浓度质控溶液10 μL,加入人空白血浆190 μL,涡旋2 min后，配制成含有环泊酚质量浓度分别为30、250、1 600 ng·mL-1和丙泊酚质量浓度分别为60、500、3 200 ng·mL-1的3种质控样品溶液，每个质量浓度5份，同一天内按“血浆样品处理”项下方法处理并测定，计算日内精密度和准确度；连续3 d处理并测定，计算日间精密度和准确度。配制低、中、高3种质量浓度的质控样品溶液，每个质量浓度5份，按“血浆样品处理”项下方法处理测定。另取相应浓度的对照品溶液及内标对照品溶液直接进样。根据质控样品峰面积与等量对照品溶液和内标溶液直接进样峰面积的比值计算绝对回收率。

基质效应取6份不同来源的人空白血浆适量按照“血浆样品处理”项下方法加入不含内标的纯乙腈处理，取上清液即为空白基质溶液，取低、中、高质量浓度质控溶液10 μL,分别加入空白基质溶液190 μL,内标工作液10 μL,涡旋混匀后测定，每个质量浓度平行测定5份。以50%乙腈代替空白基质其余操作同上，根据上述各浓度样品中待测物和内标的峰面积与等量对照品溶液峰面积的比值，计算得到待测物经内标校正的基质效应。

稳定性配制含30、250、1 600 ng·mL-1的环泊酚和60、500和3 200 ng·mL-1丙泊酚的模拟血浆质控样品5组，每个质量浓度5份。一组按“血浆样品处理”项下方法立即处理并测定，一组处理后置于自动进样器24 h再进样测定，考察进样器稳定性。另外3组质控样本分别经室温放置8 h、-40 ℃储存30 d以及反复冻融3次之后按“血浆样品处理”项下方法处理后进样测定，考察环泊酚和丙泊酚的短期稳定性、长期稳定性和冻融稳定性。

4 方法学应用

对接受环泊酚或丙泊酚全麻的择期手术患者血浆中药物浓度进行分析，考察本方法的适用性。收集麻醉诱导成功后进入维持期2 min时患者的静脉血液样本于3 mL抗凝管中，以3 500 r·min-1离心10 min, 取上层血浆于-40 ℃冻存备用。血浆样品按“血浆样品处理”项下方法处理后进样测定。本研究经河北医科大学第二医院科研伦理委员会批准(伦理批号：2023-R453)。所有受试者或法定代理人均签署知情同意书。

二、结果

1 方法学评价

专属性环泊酚、丙泊酚和内标D6-环泊酚的保留时间分别在4.21、4.05和4.20 min。结果表明，本研究建立方法专属性高，人血浆中的内源性物质对待测物和内标均无干扰。色谱图见图1。

标准曲线与定量下限人血浆中环泊酚浓度在15～2 000 ng·mL-1内线性关系良好，标准曲线方程为y=1.94×10-3x+8.17×10-3(r2=0.999 3),定量下限为15 ng·mL-1;人血浆中丙泊酚浓度在30～4 000 ng·mL-1内呈线性关系，标准曲线方程为y=3.29×10-3x+6.90×10-2(r2=0.998 6),定量下限为30 ng·mL-1。

精密度与回收率低、中、高质量浓度环泊酚和丙泊酚质控样本的日内和日间精密度的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)均小于9%,相对误差不超过±6%,环泊酚和丙泊酚在人血浆中的绝对回收率分别为91.08%～95.36%和90.75%～96.85%,内标D6-环泊酚绝对回收率为94.32%,表明该方法符合生物样本分析要求，且重现性好，结果见表1。

基质效应环泊酚质控样品经内标校正后的基质效应在±4%内，RSD为5.80%～6.50%;丙泊酚质控样品经内标校正后的基质效应在±7%内，RSD为4.68%～6.36%,均符合生物样本分析标准。

表1用液相色谱-质谱法检测人血浆中环泊酚与丙泊酚的精密度、准确度、绝对回收率

图1人血浆样品的液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)图

稳定性低、中、高3种浓度的质控模拟人血浆样品经室温放置8 h、-40 ℃储存30 d、反复冻融3次后以及处理后置于自动进样器24 h均保持稳定，RSD均小于10%,表明在上述条件下待测物稳定性良好。

2 方法学应用

本研究选取我院行择期手术患者共21例，其中应用环泊酚或丙泊酚单药完成全麻诱导和维持的患者各10例，以及应用丙泊酚诱导麻醉后，用环泊酚维持麻醉的患者1例。结果显示，临床患者单独应用环泊酚或者丙泊酚进行麻醉诱导和维持2 min后的血药浓度范围分别为511.23～1 135.66 ng·mL-1和1 749.75～2 796.43 ng·mL-1;1例应用丙泊酚诱导+环泊酚维持患者血浆中环泊酚和丙泊酚的浓度分别为388.82 ng·mL-1和1 015.98 ng·mL-1。21例患者血浆中环泊酚和丙泊酚的平均浓度分别为(676.99±207.99)ng·mL-1和(2 159.71±510.93)ng·mL-1。

三、讨论

凭借安全性方面的诸多优势，环泊酚已经在临床镇静和麻醉中占据重要地位，并且有进一步扩张的趋势[11-12]。2项在中国完成的Ⅰ期临床试验结果表明，环泊酚单次静脉注射或者静脉注射负荷剂量后继续维持给药2种模式下在健康受试者体内的药代动力学特性与丙泊酚类似。2种药物的麻醉效果与血药浓度之间均存在密切的联系，通过监测其血药浓度，可以及时地调整给药方案，既能够满足临床麻醉过程，也能有效控制术后并发症，为临床合理用药提供理论参考[13-14]。

甲酸水/甲醇是液相色谱-质谱法测定丙泊酚浓度最常用的流动相[15-16]。本研究改用背景噪音更低，洗脱能力更强的乙腈作为有机相，可以使待测物峰宽相对更窄、峰型更好。此外，鉴于环泊酚为弱酸性化合物，因此在水相中加入0.01%的氨水提供弱碱性环境(pH ≈ 8.1)来提高响应。经进一步比较优化，通过在水相加入乙酸铵，可以提供充足的铵根离子，改善色谱峰拖尾并升高响应50%左右，也可以避免因加入过量的碱而影响色谱柱的寿命。相较于既往研究中选用麝香草酚或者卡马西平作为测定丙泊酚时的内标[17-18],本实验选用与待测物化学结构更为相似的氘代试剂作为内标化合物，拥有与环泊酚基本相同的物理化学性质、色谱行为和响应特征[19]。因此，更有利于准确定量。此外，D6-环泊酚比环泊酚高6个质量单位，能够有效避免同位素干扰[20]。

本研究建立了一种能够同时测定人血浆中环泊酚和丙泊酚浓度的液相色谱-质谱法，该方法灵敏度高，稳定性好，操作简单高效，检测浓度范围满足临床实际需要。

参考文献:

[4]邹玉华.不同麻醉深度指数对ERCP术中十二指肠蠕动的影响[D].宁夏银川:宁夏医科大学,2023.

[17]范秀双.丙泊酚定量分析方法研究及氮化硼量子点在多巴胺检测中的应用[D].吉林长春:吉林大学,2022.

[18]李莉,李培.反相高效液相梯度洗脱法测定人血浆中丙泊酚浓度[J].安徽医药,2015,19(4):669—672.

基金资助:河北省医学科学研究课题计划资助项目(20241993);

文章来源:路明,霍许花,高金贵,等.用LC-MS/MS法测定人血浆中环泊酚与丙泊酚的浓度[J].中国临床药理学杂志,2024,40(21):3158-3162.