首页 > 论文范文 > 医药卫生论文 > 药学论文 > 药物鉴定论文 > 人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑与胆红素使用HPLC梯度法测定含量研究

人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑与胆红素使用HPLC梯度法测定含量研究

2020-07-20 1277 上传者：管理员

摘要：目的:采用HPLC梯度法同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑与胆红素的含量。方法:用稀释剂超声对样品进行前处理，以C18柱为分析柱，流动相为A相:甲醇-1%冰醋酸(20∶80) B相:三氯甲烷-甲醇(8∶2)进行梯度洗脱，检测波长甲硝唑:314 nm，胆红素:454 nm，流速为1. 0 mL•min-1。结果:甲硝唑平均加样回收率为100. 1%,RSD=0. 7(n=9)，在0. 20～1. 4μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系(r=1. 000 0,n=7);胆红素平均加样回收率为98. 7%,RSD=0. 8(n=9)，在0. 08～0. 14μg范围内，进样量与峰面积值呈良好的线性关系(r=0. 998 3,n=7)。结论:本法专属性强，操作简便，结果准确可靠。

关键词：
HPLC
人工牛黄甲硝唑胶囊
含量测定
甲硝唑
胆红素
加入收藏

人工牛黄甲硝唑胶囊是临床上常用的一种抗菌消炎药物，其由人工牛黄与甲硝唑混合后制成的复方制剂，用于急性智齿冠周炎、局部牙槽脓肿、牙髓炎、牙根炎等。人工牛黄甲硝唑胶囊现行质量标准[1]是分开测定甲硝唑与胆红素来控制制剂的含量。实践中发现在胆红素的测定方法中，胆红素对照品溶液与供试品溶液的峰面积悬殊太大，造成测定结果误差。本文在改进原法基础上兼顾甲硝唑与人工牛黄采用HPLC梯度洗脱法同时测定含量，方法简便，易于操作，结果准确。

1、仪器与试药

1.1仪器

Agilent 1260高效液相色谱仪，UV-2550型紫外-可见分光光度仪(日本岛津)。

1.2试药

对照品甲硝唑(批号:100191-201808，纯度为100.0%，供含量测定用)和胆红素(批号:100077-200503，供含量测定用)由中国食品药品检定研究院提供。人工牛黄甲硝唑胶囊由修正药业集团长春高新制药有限公司生产，批号为180206;湖南汉森制药股份有限公司生产，批号1903205;哈药集团三精明水药业有限公司生产，批号1801024;三氯甲烷为分析纯，洛阳市化学试剂厂;甲醇为色谱纯，默克股份两合公司，冰醋酸为分析纯，天津市科密欧化学试剂有限公司。

2、方法与结果

2.1色谱条件[3]

EldathEP-C18柱(4.6 mm×250 mm,5μm);流动相A相[2]:甲醇-1%冰醋酸(20∶80)B相[3]:三氯甲烷-甲醇(8∶2)，按以下程序进行梯度洗脱:0～7min,A 100%,B 0;7～8 min,A100%→2%,B 0→98%,8～18 min A 2%,B 98%,18～19 min,A 2%→100%,B 98%→0,,19～24 min,A 100%,B 0;流速1.0 m L·min-1;柱温:30℃，检测波长甲硝唑:314nm，胆红素:454 nm，按以下程序进行改变测定波长:0～10 min用314 nm,10～11 min由314 nm改变为454 nm,11～24 min用454 nm;进样量10μL。

2.2溶液的配制

2.2.1系列标准品溶液

分别精密称取甲硝唑对照品0.100 38 g与胆红素对照品0.009 68 g置同一50 m L棕色量瓶中，加稀释剂[三氯甲烷-甲醇-1%冰醋酸[5](90∶10∶0.5)]适量，超声20 min溶解，放置至室温并加稀释剂稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。

分别精密吸取对照品储备液1、2、3、4、5、6、7m L分置7个100 m L棕色量瓶中，各加稀释剂稀释至刻度，摇匀，制得每1 m L含20、40、60、80、100、120、140μg的甲硝唑系列对照品溶液和每1 m L含2、4、6、8、10、12、14μg的胆红素系列对照品溶液。

2.2.2供试品溶液

供试品溶液(1)取供试品30粒，除去囊壳，精密称定，研细，精密称取细粉适量(约相当于甲硝唑0.1 g)置100 m L量瓶中，加稀释剂适量，超声处理20 min，放冷，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 m L置50 m L量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液(1)。

供试品溶液(2)[4]精密称取上述“供试品溶液(1)”项下剩余细粉适量(约相当于人工牛黄50 mg)置50 m L棕色量瓶中，加稀释剂适量，超声处理20 min，放冷，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用0.45μm微孔滤膜滤过，作为供试品溶液(2)。

2.2.3阴性溶液

按处方比例同供试品(1)、(2)制备阴性溶液(1)、(2)。

2.3线性关系考察

按“2.1”项下的色谱条件，分别精密吸取“2.2.1”系列标准品溶液10μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，记录色谱图(见图1)。分别以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线，计算得甲硝唑和胆红素的回归方程分别为:

公式1

结果表明甲硝唑在0.20～1.4μg范围内具有良好的线性关系;胆红素在0.080～0.14μg范围内具有良好的线性关系。

2.4精密度试验

精密吸取甲硝唑对照品浓度分别为40、80、120μg·m L-1的溶液各10μL，分别连续进样6次，测得峰面积的RSD分别为0.3%、0.5%、0.7%;胆红素对照品浓度分别为4、8、12μg·m L-1的溶液各10μL，分别连续进样6次，测得峰面积的RSD分别为0.8%、0.7%、0.7%。

2.5稳定性试验

取修正药业集团长春高新制药有限公司生产，批号为180206的供试品溶液(1)、(2)分别在0、1、2、4、8、12、24 h后测定，记录峰面积，甲硝唑峰面积的RSD为0.8%，胆红素峰面积的RSD为1.1%。结果表明:供试品溶液(1)、(2)在24 h内稳定。

2.6重复性试验

取修正药业集团长春高新制药有限公司生产的供试品(批号180206)6份，按“2.2.2”项下方法分别制备供试品溶液(1)、(2)，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，测得峰面积并计算含量，甲硝唑的平均含量为标示量的100.7%,RSD=0.7%,(n=6);每粒中人工牛黄以胆红素计算平均含量为0.042 mg,RSD=0.9%(n=6)

2.7定量限

取“2.2.1”中甲硝唑浓度为20μg·m L-1的溶液适量，加稀释剂稀释制成每1 m L约含0.06μg的溶液，精密量取10μL，照“2.1”项下方法测定，按10倍信噪比计算，甲硝唑的定量限为0.6 ng;另取“2.2.1”中胆红素浓度为2μg·m L-1的溶液适量，加稀释剂稀释制成每1 m L约含0.1μg的溶液，精密量取10μL，照“2.1”项下方法测定，按10倍信噪比计算，胆红素的定量限为1 ng。

2.8加样回收试验

2.8.1甲硝唑

取修正药业集团长春高新制药有限公司生产的供试品(批号180206，含量已知)60粒，除去囊壳，研细，精密称取细粉适量(约相当于甲硝唑50 mg)，称取9份，分置100 m L量瓶中，各加入甲硝唑对照品30 mg、50 mg、70 mg，按“2.2.2”项下供试品溶液(1)制备方法制备，照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图，测得峰面积，计算回收率。结果见表1。

2.8.2胆红素

取“2.7.1”项下细粉，精密称取适量(约相当于人工牛黄25 mg)，称取9份，分置50mL棕色量瓶中，各加入胆红素对照品溶液(精密称取胆红素对照品0.010 43 g置25 m L棕色量瓶中，加稀释剂适量溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取10 m L置100 m L棕色量瓶中，加稀释剂稀释至刻度，摇匀，即得。)3 m L、5 m L、7 m L，按“2.2.2”项下供试品溶液(2)制备方法制备，照“2.1”项下的色谱条件，进行测定，记录色谱图，测得峰面积，计算回收率。结果见表1、2。

表1甲硝唑加样回收试验测定结果(n=9)

表2胆红素加样回收试验测定结果(n=9)

2.9样品测定

取“2.2”项下系列标准品溶液、供试品溶液(1)、(2)，照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图(见图2)，测得峰面积。按外标法，以峰面积分别计算甲硝唑与人工牛黄以胆红素计的含量，结果见表3、4。

取“2.2.3”项下阴性溶液(1)、(2)，照“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图(见图3)。

表3供试品中甲硝唑的含量测定结果(n=3)

表4供试品中人工牛黄以胆红素计的含量测定结果(n=3)

图1甲硝唑与胆红素对照品溶液色谱图

图2供试品溶液(1)色谱图

图3供试品溶液(2)色谱图

图4阴性溶液色谱图(1)、(2)

图5甲硝唑与胆红素对照品溶液紫外-可见光谱图

3、讨论

3.1检验方法改进的原因

在平时的检验工作中发现:人工牛黄甲硝唑胶囊的检验标准中关于胆红素的检验方法有些问题。按原标准胆红素对照品溶液浓度8 mg·mL-1，供试品溶液浓度1 mg·mL-1，在通过高效液相色谱仪检测后，两者峰面积相差太大，易造成计算结果的误差，难以准确指示胶囊中人工牛黄的含量;另外甲硝唑也是本制剂中的重要成分，因此考虑通过一个系统同时检测出甲硝唑与人工牛黄的含量达到控制制剂质量的目的，经过多次试验总结，得出本方法。

3.2供试品提取溶剂的选择

甲硝唑与胆红素溶解性差异较大，因此本方法采用稀释剂[三氯甲烷-甲醇-1%冰醋酸(90:10:0.5)]超声来提取供试品，二者兼顾;本法通过使用冰醋酸、盐酸、磷酸对供试品的提取效果进行比较，冰醋酸的提取效果较好，色谱峰的对称性也高。由于每粒中甲硝唑与胆红素的含量相差较大，所以在制备供试品时考虑到有效成分的含量及溶解性，分开制备供试品溶液。

3.3测定波长的选择

精密称取甲硝唑对照品适量与胆红素对照品适量置同一棕色量瓶中，以稀释剂超声溶解并配成含60μg·m L-1的溶液，按紫外-可见分光光度法，以稀释剂为空白，在255～530 nm波长范围内扫描，结果甲硝唑在314 nm的波长处有最大吸收，胆红素在454 nm的波长处有最大吸收。见图5。辅料按处方比例同法制备溶液扫描，结果在255～530 nm波长范围内无吸收，对供试品的测定无干扰。

3.4色谱条件的选择

在梯度洗脱过程中，曾用A相:10%、5%、3%、2%B相:90%、95%、97%、98%等比例来分析测定供试品，结果由于水相比例加入量的增多，甲硝唑峰形越好;胆红素峰形差且有裂峰趋势，水相比例加入减少，甲硝唑峰形尚可，但峰面积减少;胆红素峰形越好且未裂开，为了兼顾甲硝唑峰与胆红素峰采用A相:2%B相:98%最合适。

3.5小结

在实验基础上总结而得的HPLC梯度洗脱法同时测得甲硝唑与胆红素的检测方法:简便易操作，检测灵敏度高，测得结果准确可靠。纠正了原标准中由于胆红素对照品溶液峰面积与供试品溶液峰面积相差悬殊而造成的计算误差;改进了原标准中甲硝唑的含量测定方法，提高了甲硝唑的测定准确度。新的检测方法可同时控制甲硝唑与人工牛黄的含量，简化了实验步骤，切实可行。适用于人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑与人工牛黄的含量测定。

参考文献：

[1]国家药品标准化学药品地方标准上升国家标准第三册[S].2002:15

[2]中华人民共和国药典2015年版.二部[S]. 2015:312ChP 2015. VolⅡ[S]. 2015:213

[3]中华人民共和国药典2015年版.一部[S]. 2015:6ChP 2015. VolⅠ[S]. 2015:6

[4]赵珊珊,罗定强,吴芳,等.高效液相色谱法测定小儿化毒胶囊人工牛黄中胆红素含量[J].中国药业,2018,27(6):11

[5]罗珍妹,陈晓玲.高效液相色谱法测定人工牛黄中胆红素含量[J].海峡药学,2010,22(6):48

薛晓会,叶晓娅,王淑静,段李静.HPLC梯度法同时测定人工牛黄甲硝唑胶囊中甲硝唑与胆红素的含量[J].中国药品标准,2020,21(03):218-222.