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复方氨基酸注射液(20AA)中焦谷氨酸和醋酸根使用HPLC法测定结果分析

2020-07-20 625 上传者：管理员

摘要：目的建立同时测定复方氨基酸注射液(20AA)中焦谷氨酸、醋酸根的HPLC方法。方法采用GL Sciences Inertsil ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；流动相：乙腈–5 mmol/L磷酸溶液(磷酸调pH 2.5)，采用梯度洗脱；检测波长：210 nm；体积流量：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量：15μL。结果在上述色谱条件下，焦谷氨酸、醋酸根峰与各自相邻峰的分离度均大于2.0；焦谷氨酸和醋酸根的定量限分别为0.10、0.99μg/mL，检测限分别为0.03、0.30μg/mL；焦谷氨酸和醋酸根分别在0.1～120.0μg/mL、0.6～540.0μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。焦谷氨酸和醋酸根的回收率分别为100.04%、98.39%,RSD值分别为0.12%、0.70%。结论本方法简便、灵敏度高、重现性好，适用于复方氨基酸类制剂中焦谷氨酸和醋酸根的同时检测。

关键词：
复方氨基酸注射液(20AA)
焦谷氨酸
醋酸根
高效液相色谱
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复方氨基酸注射液（20AA）是由20种L-氨基酸配制而成的无菌复方制剂，临床上作为全肠外营养系统的一部分用于预防和治疗肝性脑病，可满足肝功能衰竭状态下的特殊代谢需要，并用于肝病或肝性脑病急性期的静脉营养以及其他原因引起的营养不良的肠道外营养治疗。复方氨基酸注射液（20AA）中氨基酸总量占比为10%，富含精氨酸、门冬氨酸、谷氨酸、鸟氨酸等多种降氨组分，可以纠正氨中毒，在供给充分营养的同时有效预防各种肝性脑病。其中谷氨酸含量高达5.70 mg/mL。谷氨酸在高温灭菌和储存过程中易发生脱水缩合反应，降解形成焦谷氨酸[1]。焦谷氨酸在体内能够结合谷氨酸受体，抑制谷氨酸的摄取，对人体中枢神经系统产生不良影响[2]。焦谷氨酸还会导致机体产生阴离子间隙增高的代谢性酸中毒[3]。复方氨基酸注射液（20AA）中醋酸根主要来源于原料醋酸赖氨酸，同时调节制剂p H值也可能引入醋酸根。醋酸根含量的高低会影响终产品的pH值，而p H值对产品的稳定性起着至关重要的作用。研究表明，谷氨酸的稳定性与温度、p H值的变化直接相关，在p H值小于侧链的p Ka值（p Ka=4.25）时，谷氨酸的稳定性降低，更易降解产生焦谷氨酸[4]。因此，醋酸根的含量与焦谷氨酸的形成也存在潜在的相关性。关于焦谷氨酸的HPLC分析方法多集中于味精、咖啡、血浆以及人角质层等样本的测定[5,6,7,8]。醋酸根的检测方法主要包括气相色谱法、HPLC法、离子色谱法、滴定法等[9,10,11,12]。为了进一步提高产品的分析检测效率，本研究采用HPLC法同时测定复方氨基酸注射液（20AA）中焦谷氨酸和醋酸根，为复方氨基酸类制剂质量标准的提高和完善提供实验依据。

1、仪器与试药

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2489UV/VIS检测器，Empower 3.0色谱工作站；Mettler Toledo XS205型十万分之一电子天平。

焦谷氨酸（批号140763-201602，质量分数100.0%）、无水醋酸钠（批号100735-201502，质量分数100.0%）、异亮氨酸（批号140683-201302，质量分数99.9%）、酪氨酸（批号140609-201513，质量分数99.8%）对照品均购自中国食品药品检定研究院；复方氨基酸注射液由德国贝朗医疗股份公司提供，规格500 m L∶50 g，批号180248061、181548062、181548063；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯；实验用水为超纯水。

2、方法与结果

2.1色谱条件

GL Sciences Inertsil ODS-3色谱柱（250mm×4.6 mm,5μm）；流动相A:5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5），流动相B：乙腈–流动相A(80∶20），采用梯度洗脱（0～15 min,0%B;15～20 min,0%→100%B;20～24 min,100%B;24～25 min,100%→0%B;25～40 min,0%B）；检测波长：210 nm；体积流量：1.0 mL/min；柱温：25℃；进样量：15μL。

2.2溶液的配制

2.2.1供试品溶液的制备

精密量取复方氨基酸注射液（20AA)3 mL，置25 mL量瓶中，用5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5）稀释并加至刻度，摇匀，即得。

2.2.2对照品溶液的制备

分别取无水醋酸钠、焦谷氨酸对照品各适量，精密称定，加5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5）溶解，并稀释制成约含醋酸钠525μg/mL、焦谷氨酸100μg/mL的对照品溶液，即得。

2.2.3阴性样品溶液的制备

按处方量精密称取原辅料（除醋酸赖氨酸、谷氨酸外），配制成与供试品溶液相同质量浓度的溶液，作为阴性样品溶液。

2.2.4系统适应性溶液的制备

分别取无水醋酸钠、焦谷氨酸、异亮氨酸和酪氨酸对照品各适量，用5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5）溶解并稀释制成约含醋酸钠525μg/mL、焦谷氨酸100μg/mL、异亮氨酸600μg/mL、酪氨酸25μg/mL的混合溶液，作为系统适用性溶液。

2.3系统适应性试验

取系统适用性溶液，进样测定，记录色谱图，结果见图1。醋酸根与异亮氨酸、焦谷氨酸与酪氨酸的分离度均大于2.0，符合要求。焦谷氨酸、醋酸根的理论板数分别为13 669、13 448。连续进样6次，焦谷氨酸和醋酸根峰峰面积、出峰时间的RSD值均小于2.0%。

图1系统适用性试验色谱图

2.4专属性试验

精密量取对照品溶液、供试品溶液（批号180248061）、阴性样品溶液各15μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图2。结果阴性样品溶液在与焦谷氨酸、醋酸根对照品相同保留时间处无色谱峰出现，表明阴性样品对检测无干扰。

2.5定量限与检测限考察

精密量取焦谷氨酸、醋酸根对照品溶液适量，逐级稀释，进样测定，记录信噪比（S/N）为10、3的色谱峰，分别计算定量限、检测限的限值。结果焦谷氨酸、醋酸根的定量限分别为0.10、0.99μg/mL，检测限分别为0.03、0.30μg/m L。

图2对照品溶液（A）、供试品溶液（B）和阴性样品溶液（C）的HPLC图谱

2.6线性关系考察

精密称取焦谷氨酸对照品适量，用5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5）溶解并稀释成分别含焦谷氨酸0.1、1.0、10.0、30.0、50.0、80.0、100.0、120.0μg/mL的溶液，作为焦谷氨酸对照品线性系列溶液。精密称取无水醋酸钠对照品适量，用5mmol/L磷酸溶液（磷酸调pH 2.5）溶解并稀释成分别含醋酸钠0.6、36.0、72.0、144.0、288.0、360.0、432.0、540.0μg/mL的溶液，作为醋酸根对照品线性系列溶液。分别进样测定，记录色谱图。以质量浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，进行线性回归。焦谷氨酸回归方程Y=5615 X+1 451.3,r=1.000 0；醋酸根回归方程Y=29 291 X-324.2,r=1.000 0。结果焦谷氨酸、醋酸根分别在0.1～120.0μg/m L、0.6～540.0μg/mL与峰面积呈良好线性关系。

2.7精密度试验

精密量取对照品溶液，连续进样6次，记录所测成分焦谷氨酸、醋酸根的峰面积，结果焦谷氨酸、醋酸根峰面积的RSD值分别为0.08%、0.03%。

2.8重复性试验

取批号180248061复方氨基酸注射液（20AA）样品，平行制备6份供试品溶液，进样测定。结果所测焦谷氨酸、醋酸根质量浓度的RSD值分别为0.47%、0.39%。

2.9稳定性试验

取批号180248061复方氨基酸注射液（20AA）样品，制备供试品溶液，在室温下放置0、2、4、8、12、16、20、24 h后进样测定，记录色谱图。结果供试品溶液中焦谷氨酸、醋酸根峰面积的RSD值分别为0.38%、1.08%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。

2.1 0回收率试验

取批号180248061复方氨基酸注射液（20AA）样品1.5 mL，置25 mL量瓶中，平行制备9份，分别精密加入另行配制的混合对照品溶液（焦谷氨酸0.2 mg/mL、醋酸根6 mg/mL)0.8、1.0、1.2 mL，用5 mmol/L磷酸溶液（磷酸调p H 2.5）加至刻度，混匀。每个质量浓度平行3份，进样测定。结果焦谷氨酸、醋酸根平均回收率分别为100.04%、98.39%,RSD值分别为0.12%、0.70%。

2.1 1样品测定

取批号180248061、181548062、181548063复方氨基酸注射液（20AA）样品，制备供试品溶液，依法进样，按外标法以峰面积计算焦谷氨酸和醋酸根，结果见表1。

表1复方氨基酸注射液（20AA）中焦谷氨酸、醋酸根的测定结果（n=3)

3、讨论

3.1流动相的优化与考察

实验对乙腈–5 mmol/L磷酸溶液、甲醇–5mmol/L磷酸溶液、乙腈–10 mmol/L磷酸氢二铵溶液[13,14]、乙腈–辛烷磺酸钠溶液[7]分别作为流动相体系进行试验，结果显示乙腈–5 mmol/L磷酸溶液系统下各相邻组分分离度较佳，并考察采用磷酸分别调节p H 2.0、2.5、3.0，结果发现磷酸调节p H 2.5条件下基线平稳，各色谱峰理论塔板数和拖尾因子均为最佳。

3.2耐用性试验

考察色谱柱种类、柱温、体积流量以及流动相磷酸溶液的比例变化对焦谷氨酸、醋酸根测定的影响。比较了GL Sciences Inertsil ODS-3色谱柱（250mm×4.6 mm,5μm）和Agilent ZOR BAX SB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm,5μm）对焦谷氨酸、醋酸根检测的影响，结果表明两种色谱柱分离成分的色谱行为差异不大，均符合系统适用性要求，均可用于复方氨基酸注射液（20AA）中焦谷氨酸、醋酸根的检测。柱温、体积流量以及流动相磷酸溶液的比例发生微小变动对焦谷氨酸和醋酸根的测定无影响，方法耐用性良好。

复方氨基酸注射液（20AA）成分较多，包含20种氨基酸、乙二胺四醋酸二钠等辅料，基质非常复杂，因此其他组分易干扰焦谷氨酸、醋酸根的测定。在本实验色谱系统下，焦谷氨酸与酪氨酸、醋酸根与异亮氨酸出峰时间非常接近。因此，通过考察流动相体系、色谱柱的适用性来实现上述相邻峰的分离是本实验的关键技术难点。焦谷氨酸是复方氨基酸注射液（20AA）高温灭菌工艺过程中产生的重要杂质，而醋酸根则会影响终产品的p H值，均需要严格控制。本实验建立了同时测定复方氨基酸注射液中两种重要组分的方法，大大缩短分析周期，提高检测效率，且具有普适性，适用于检测同时含谷氨酸、醋酸盐的复方氨基酸类产品。本实验采用梯度洗脱法，准确度高，操作简便，所测两个组分与其他成分（酪氨酸、异亮氨酸）分离效果佳，耐用性强，可以为复方氨基酸注射液（20AA）的质量控制、标准提高提供参考。

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基金:国家自然科学基金面上项目(31970667);重大新药创制国家科技重大专项(2019ZX09721001-006-001);国家药典委员会药品标准制修订研究课题(2019H03);天津市“131”创新型人才培养工程项目.