显微常数测定和显微定量是中药材显微鉴定中常用的方法[1,2]。主要是利用药材某一显微特征如花粉粒、晶体、石细胞、油细胞、叶表皮组织等的独特性对药材进行定性或对中成药中某种药材成分进行定性定量[3,4,5]。现有研究表明中药材的某些显微特征常数还与其有效成分有相关性[6,7,8]。与叶表皮组织有关的显微常数主要包括表皮细胞形态、垂周壁类型、气孔轴式、气孔密度、气孔指数、脉岛数和栅表比等，这些指标在同种植物中相对稳定，常被用来鉴定常见叶类药材的混淆品和伪品[9,10]，同时，这些形态特征具有较高的分类学和系统学的价值，也是探讨药用植物亲缘关系的主要特征[11,12,13,14,15]，为药用植物的分类和系统演化提供一定的科学依据。

近年来，叶表皮显微特征主要用于药用植物基原物种的真伪鉴定，聚焦的类群往往局限于同属的1～2个物种[9,10]。对不同科属的常见药用植物叶表皮的显微特征比较研究较少。叶表皮显微特征在不同科属药用植物中鉴别的可靠性有待于进一步评估。因此，本实验基于25科共40种常见药用植物的叶表皮显微常数观察比较研究，探讨叶表皮显微常数在不同药用植物中显微鉴别的差异性，为药用植物资源的开发利用和常见大宗药材的显微鉴定提供理论依据。

1、材料与方法

1.1 材料

试验材料均采自河南中医学院药用植物园，共25科40种，见表1。以上材料由河南农业大学高致明教授和夏至副教授鉴定。2019年7月，供试当天10⁚00—11⁚00时随机选取生长健壮的药用植物各3株，取中部完整健康叶片供试。

1.2 方法

1.2.1 气孔各项指标的观察和测定

取各种植物的完整新鲜叶片，洗净后用镊子撕取下表皮，修剪成合适尺寸，做成临时装片，观察气孔轴式、叶表皮细胞形状及其垂周壁形态；测量气孔密度和气孔指数。气孔密度指单位面积内的气孔数目。用显微描绘器描出1mm2的方形图像，计算方形图像内的气孔数目，不同叶片重复检视20次，求其平均值。用显微描绘器描出1mm2的方形图像，计算方形图像内气孔数目（S）和表皮细胞数目（P）。根据公式求出气孔指数（I）。不同叶片重复检视20次，取其平均值。

1.2.2 栅表比的测定

取新鲜植物叶片，撕取上表皮置于试管中，加水合氯醛试液2mL，在沸水浴中加热至材料完全透明。滴加稀甘油制成临时装片，测量栅表比。栅表比指叶肉中一个表皮细胞下的平均栅栏细胞数目。在高倍镜（40倍）下找出相邻5个表皮细胞，计算其下面栅栏细胞数目，将总数除以5得出栅表比。按上述方法重复检视20次，取其平均值。

1.2.3 脉岛数的观察

取新鲜植物叶片，在叶片中脉两侧，剪取长15mm，宽10mm的矩形块，置于试管中，加入20倍量透化液（水合氯醛与乙醇等量混合），放入70℃水浴锅进行热浴透化，视叶片厚薄透化5～20h；后倾去透化液，水洗3次，每次数秒钟；再加入适量10%盐酸于试管中，70℃水浴锅中热浸45min洗去晶体，水洗3次后进行二次透化，直至能清晰区分叶肉与细脉。用低倍镜（10倍）拍摄10个相邻的视野，计算脉岛数目，求出每平方毫米脉岛数。按上述方法重复检视20次，取其平均值。使用moticBA310光学显微镜及moticam2506数码摄像系统进行观察拍照测量。使用Excel和SPSS25.0软件进行数据分析。

2、结果与分析

2.1 不同药用植物叶片气孔器的细胞形态及气孔轴式

通过对25科40种药用植物的气孔器细胞形态及气孔轴式进行研究，结果表明，除了单子叶植物禾本科药用植物，其他药用植物气孔器保卫细胞的形态均为肾形。以Dileher系统[16,17,18]为参照，根据副卫细胞的数量和排列方式将气孔轴式分为不规则类、不等类、横列类、平列类、四细胞5种类型，见图1。

不规则类指保卫细胞为肾形，周围有3至多数副卫细胞以无规则方式排列，副卫细胞的形状、大小和垂周壁的形态与表皮细胞无异。具有此类型气孔轴式的药用植物有19种，占了所观察种类的47.5%。不等类包括不等型和双不等型。不等型是指副卫细胞有3个，排成一轮，两大一小，其中较小的副卫细胞多与保卫细胞近平行排列。萹蓄、柴胡、紫花地丁、菘蓝和羊蹄属于此种类型；双不等型指有2轮副卫细胞，内轮细胞2大1小，外轮细胞不等。如轮叶八宝和佛甲。平列类指有2个副卫细胞完全包围着保卫细胞，且其长轴与保卫细胞的长轴平行。包括平列型、不等平列型和双平列型。泽泻、乌桕和鸡屎藤属于平列型，2个副卫细胞肾形，垂周壁平滑或近平滑，垂周壁形态区别周围表皮细胞。不等平列型指2个副卫细胞1大1小，其垂周壁相态近似于其他表皮细胞，如决明。双平列型是指有4个副卫细胞成2轮平行保卫细胞排列，如马齿苋。横列类：指2个副卫细胞包围保卫细胞，其长轴与保卫细胞的长轴垂直或成一定的角度。

如夏枯草、地笋和紫苏。其中夏枯草和地笋的副卫细胞明显比周围表皮细胞小，垂周壁平滑，而紫苏的2个副卫细胞与周围表皮细胞的大小、形状及垂周壁的形态相近。四细胞类指有4个保卫细胞较规则排列在保卫细胞周围，单子叶植物多属于这种类型，包括十字型、禾本科型和平列型。十字型指4个副卫细胞大小近相等，其长轴与保卫细胞的长轴平行，2个位于两极，另2个位于保卫细胞的两侧，呈十字型排列，如黄精、玉竹和射干。黄精与玉竹的副卫细胞为近长方形；射干的副卫细胞近菱形。禾本科型指保卫细胞哑铃形，位于两极的两个副卫细胞近长方形，两侧的2个副卫细胞近三角形，如薏苡。短平列型指2个短副卫细胞位于保卫细胞两侧，与保卫细胞近等长，2个窄宽的副卫细胞位于保卫细胞的两极，其长轴与保卫细胞的长轴垂直。如紫玉簪和白及。

2.2 不同药用植物叶片表皮细胞形状及垂周壁镶嵌类型

不同药用植物表皮细胞形态各异，主要有不规则形、多边形、矩形等几种类型。50%观察药用植物的表皮细胞较规则，呈多边形，但表皮细胞的大小不等；其次为不规则形，表皮细胞大小不一，形态不定，占观察种类37.5%；其余为矩形，多为单子叶植物，如黄精、玉竹、唐菖蒲和薏苡等，双子叶植物只有佛甲草的表皮细胞为近矩形。在Dilcher[16]对垂周壁描述的基础上，将不同药用植物叶表皮细胞垂周壁的形态分为平直、平滑、V形波和U形波等几种类型（表2和图2）。平直型垂周壁指表皮细胞的垂周壁几乎呈平滑的直线；若表皮细胞的垂周壁呈平滑的曲线，但并没有形成明显的波形，称平滑型垂周壁；V形波垂周壁指垂周壁较规则的V形弯曲，若波的深度和宽度几乎相等，称为V-波形，若波的深度大于宽度则为V-深波，若波的深度小于宽度，为V-浅波；U形波垂周壁指表皮细胞的垂周壁彼此嵌合弯曲成U字，同样，若波的深度和宽度相等，形成U-波形，若深度大于宽度为U-深波，反之为U-浅波。所观察药用植物种类中，平滑型垂周壁有7种，均为双子叶植物，占观察种类的17.5%；平直型垂周壁有13种，占32.5%，其中单子叶植物有5种，包括泽泻、黄精、玉竹、紫玉簪和白及；V波形有10种，占25%，其中V-浅波有6种，V-波形3种，V-深波1种；U波形有10种，占25%，其中U-浅波1种，U-波形1种，U-深波8种。

2.3 不同药用植物叶表皮特征指数

2.3.1 不同药用植物叶表皮气孔参数

气孔参数是因植物种类不同有较大的差异，且同一物种具有相对稳定性[19,20]。对25科40种药用植物气孔密度、气孔指数和其他衡量气孔大小的指标进行观察测量（表3）。25科40种药用植物的气孔指数平均为20.82，最小的为泽泻为8.30，最大的为玉竹，为35.23，气孔指数小于10只有泽泻1种，在10～20的有20种，占观察种类50%，在21～30的有15种，占37.5%,30以上的有4种，分别是黄精、玉竹、唐菖蒲和紫苏。

不同药用植物的气孔密度差异较大，气孔密度最大的为地笋，413个/mm2，最小的为马齿苋，21.67个/mm2。其中气孔密度在100个/mm2以下的有8种，由小到大分别是马齿苋、佛甲草、泽泻、泽漆、轮叶八宝、羊蹄、薯蓣、牡丹；气孔密度在100～200个/mm2有18种，占种类的45%,201～300的有9种，301以上的有5种。不同药用植物气孔大小各异，形态各异。不同药用植物气孔长最小的为柴胡，为18.27μm，最大的为马齿苋，为50.72μm，不同药用植物气孔大小各异，形态各异。不同药用植物气孔长最小的为柴胡，为18.27μm，最大的为马齿苋，为50.72μm，平均31.53μm。气孔宽最小的为薏苡，为10.10μm，最大的是紫玉簪，为35.74μm，平均为22.64μm。

不同药用植物气孔的长宽比决定了气孔的形态，黄精气孔的长宽比最小，是0.91，薏苡气孔的长宽比最大，为4.26，平均为1.47。其中1.00以下有2种，为近圆形，分别是薏苡和紫玉簪，1.00～1.50的有28种，为阔椭圆形，占全部的70%,1.51～2.00的有7种，为椭圆形，2.01以上的有3种，为长椭圆形，分别是佛甲草、凤仙花和薏苡。气孔面积最小的为柴胡，为213.52μm2，最大的为紫玉簪，为1075.74μm2。其中气孔面积在200～400μm2的有10种，占25%；在401～600μm2有17种，占42.5%;601～800μm2的有2种，801～1000μm2以上的有7种，1000μm2以上的有4种，分别是紫玉簪、泽泻、牡丹和马齿苋。

2.3.2 不同药用植物叶片的脉导数及脉岛类型

脉岛数为叶脉所环绕的最小光合作用组织数目。不同药用植物脉导数差异很大，脉导数最少的是黄精，为1.20个/mm2，最大的萹蓄，为20.44个/mm2，平均为6.69个/mm2。脉导数在1～5有15种，占全部的37.5%，在5.01～10.00个/mm2的有16种，占全部的40%,10.00～15.00个/mm2有7种，占全部的17.5%,15.01个/mm2以上的有2种，占全部的5%，分别是小蓟和萹蓄。单子叶植物除了薏苡外，脉导数都较小，在1.20～3.06个/mm2。

不同药用植物脉岛内自由末梢的数量和形态不同，形成了不同的脉岛类型。单子叶植物除了薯蓣外，脉岛形状均较规则，多为近长方形，双子叶植物脉岛多呈不规则型。根据突入自由脉梢的数量和分支情况将不同药用植物叶片的脉岛分为4种类型：寡少型、稀疏型、树状分枝型和花纹型（图3）。寡少型是指脉岛相对较规则，多为方形或不规则型，脉岛内几乎没有突入自由末梢，比如除了薯蓣的其他7种单子叶植物，叶片肉质的佛甲草和轮叶八宝。稀疏型是指脉岛内有突入的自由末梢，但较少，只有1～2条，且常不分枝。如凤仙花、栝楼、萹蓄、羊蹄、马齿苋、牡丹、芍药、龙葵、苦参9种。树状分枝型是指脉岛内自由末梢多为单条突入，突入的单条末梢再进行1～3级分枝，脉岛内突入的自由末梢呈树状分枝，如夏枯草、小蓟、大蓟、佩兰、紫苏、地笋、芍药、鸡屎藤、商陆、紫茉莉、玄参、薯蓣12种。花纹型指脉岛内自由末梢突入多条，每条又进行不同等级的分枝，每个脉岛内的自由末梢形成图案各异的花纹。如乌桕、紫花地丁、沙参、红花、金荞麦、菘蓝、柴胡、珊瑚菜、白花曼陀罗、泽漆10种。

2.3.3 不同药用植物叶片的栅表比

不同药用植物叶片栅表比差异显著，药用植物叶片栅表比的大小与表皮细胞和栅栏细胞面积有关，如图4，有图可知，在同样的放大倍数下，小蓟的叶表皮细胞与其他种相比较小，而其栅栏细胞顶端面积与其它种相比则较大，故其栅表比则较小，平均为1.63，而牡丹的则相反，牡丹的表皮细胞较大，而其栅栏细胞顶端面积则较小，其栅表比在所观察种类中则最大，为24.13。栅表比最小的为佛甲草，只有1.01，不同药用植物栅表比平均为5.02。其中栅表比在1.01～5.00的有14种，占观察种类的41.18%,5.01～10.00的有16种，占47.06,10.01以上的有4种，占11.76%。其他6种单子叶植物没有观察到栅栏细胞，没有计算栅表比，包括黄精、玉竹、紫玉簪、射干、薏苡、白及。

2.3.4 不同药用植物叶表皮特征指数的相关性

对不同药用植物叶表皮各特征指数进行相关性分析，结果见表4。气孔指数与气孔密度呈极显著正相关，与气孔的长度呈显著负相关；气孔密度与气孔长、气孔宽和气孔面积呈极显著负相关；气孔长与气孔宽呈极显著正相关，气孔长宽比与气孔长呈显著正相关，与气孔宽呈极显著负相关；脉导数与气孔密度呈显著正相关，与气孔宽和气孔面积呈极显著负相关；栅表比与其他叶表皮特征指数无显著相关性。

3、讨论

本实验选取40种25科药用植物进行叶表皮显微特征的探讨，选取样品时尽量考虑到样品的多样性和代表性，同时兼顾药用植物比较多的科，比如伞形科、唇形科、菊科等。40种25科在恩格勒系统中分属于15个目，包括双子叶植物纲离瓣花亚纲蓼目、中子目、毛茛目、罂粟目、蔷薇目、无患子目、堇菜目、葫芦目和伞形目，合瓣花亚纲的龙胆目、管花目，单子叶植物纲的沼生目、百合目、微子目和禾本目。气孔轴式在植物系统学研究中具有重要的意义[12,13,14,15]。气孔轴式分类方法有多种，各种分类依据不同，但互相有交叉重合，在各种植物学教材和专著中名称混乱。

本实验依据Dilehe系统[16]为参照，对25科40种药用植物的叶表皮气孔轴式进行分类，40种观察药用植物的叶表皮气孔轴式大多为不规则类（19种），其次是不等类（种），四细胞类（6种）、平列类（5种）和横列类（种）。除了薏苡保卫细胞是哑铃型的之外，其他种类气孔的保卫细胞均为肾形。不同药用植物表皮细胞垂周壁的形态各异，所观察药用植物种类中，平直型垂周壁较多，为32.5%，其次为V-波形和U-波形分别占观察种类的25%，最少的为平滑型，为17.5%。气孔轴式、表皮细胞的形态和其垂周壁的类型具有物种稳定性，可能在同属近缘物种具有鉴别的意义。因此在药用植物显微鉴别中并不具有专属性，在药材鉴别中要结合其他特征才能在药材鉴别中具有重要意义。

不同药用植物的气孔参数不同，50%的药用植物气孔指数多在10～20;45%的药用植物气孔密度为100～200个/mm2;70%药用植物叶片气孔器长宽比为1.00～1.50，为宽椭圆形，少数为圆形或长椭圆形；不同药用植物气孔面积在413μm2～1075μm2,42%的药用植物气孔面积在401～600μm2。植物的各种气孔参数虽具有物种差异性，但易受各种环境因素的影响[11]，因此，首先界定各种气孔参数的变化范围才能在药材显微鉴别中具有实际意义。

不同药用植物叶片脉岛数差异较大，大多数（77.5%）药用植物叶片脉导数在1.00～10.00个/mm2。本实验首次根据脉岛内自由末梢的突入形状将脉岛分为不同的类型。其中，寡少型可能是单子叶植物和叶片肉质的药用植物所具有主要脉岛类型（图3）。关于脉岛数的作为鉴定指标的意义，何报作等[21]认为同种植物的脉岛数是恒定的，不具有普适性，不同大小的广东桑叶，不同形状的水半夏叶其脉岛数均存在差异显著性。Ballard等[22]也认为叶片面积影响脉导数的恒定性。Hassan等[23]研究了马利筋属不同植物的脉导数，认为不同植物叶片脉导数存在显著差异性，且叶片的生长部位和同一叶片的不同部位其脉岛数存在差异性。

脉岛数作为鉴定指标的意义，何报作等[21]认为只要某种生药的脉岛数的变化范围与待区别生药脉岛数的变化范围不重叠，仍具有重要的鉴定意义，因此，他认为脉岛数在作为药用植物鉴定指标时应先确认其恒定性。综上所述，某种药用植物的脉岛数不是一个恒定的常数，而是有一定的变化区间。影响脉岛数变化的因素较多，除了以上提到的叶片大小、生长部位、叶片形状、同一叶片的不同部位，通过本文的研究可知脉岛数与气孔密度呈显著正相关，与气孔面积呈显著负相关。其他环境因素比如土壤肥力等对脉岛面积有显著影响，继而单位面积上的脉导数也会受显著影响[24]。因此，如何界定药用植物脉岛数的恒定性还需进一步探讨，但脉岛数结合脉岛形状，气孔密度及气孔面积可能在生药鉴别上具有相对专属性。

不同药用植物叶片栅表比差异显著。在所观察药用植物种类中，绝大多数（88.24%）的药用植物栅表比在1～10。Hassan等[23]研究了马利筋属6种植物的叶片栅表比，同属不同植物栅表比具有差异显著性，同种植物栅表比因着叶片在植株上的生长部位和同一叶片不同部位具有差异性，但其他环境因素对栅表比的影响鲜见有报道，从本文的研究中可知，栅表比与其它叶表皮特征无显著相关性，因此，栅表比在药用植物鉴定中，其“恒定性”的界定也需要进一步探讨和研究。

陆静梅[25]将植物茎、叶外切向壁特有的纹理以及印痕，包括表皮细胞、气孔器的保卫细胞和副卫细胞、以及表皮毛等宏观形态和微观结构称为植物的植纹。因此，植纹结构稳定不变，耐酸碱、高温等各种逆境。本研究探讨了部分叶表皮特征对植物的显微鉴别，基于目前对叶表皮的认识所建立的植纹特征只能有限支持鉴别出某一大类植物，很难鉴别到种。但植纹概念的提出具有重要的意义，随着对叶表皮特征认识的不断深入，越来越多的叶表皮特征和其他植纹特征的联合，将会为每种植物提供专属的植纹。目前，在药材的显微鉴定中，很多单一特征并不具有专一性，很难与其混伪品区别，因此，在药用植物种类，开展叶表皮的形态特征研究，同时，在药材的显微鉴别中引入多特征的植纹鉴别势必成为显微鉴别的主要方法。

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文章来源：李贺敏,王森,张红瑞,黄勇,周艳,夏至.基于叶表皮特征对25科40种药用植物显微鉴别的研究[J].中草药,2021,52(23):7331-7338.