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UPLC-MS/MS法测定再造丸中的4种马兜铃酸类成分

2024-08-02 107 上传者：管理员

摘要：目的采用超高效液相色谱-串联质谱法测定再造丸中马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ的含量。方法采用Waters Acquity BEH UPLC C18色谱柱（100 mm×2.1 mm,1.7μm）,以甲醇-0.1%甲酸溶液(含5 mmol•L-1甲酸铵)为流动相,梯度洗脱,流速0.3 mL•min-1,采用电喷雾离子源,正离子模式下,多反应监测模式下,用外标法定量。结果 4种马兜铃酸类成分在各自浓度范围内的线性关系良好（r>0.9990）,平均加样回收率为88.4%～102.5%,RSD均小于5%。结论所用方法的专属性好、灵敏度高、结果准确,可为再造丸的质量控制提供参考。

关键词：
再造丸
多反应监测
超高效液相色谱-串联质谱
马兜铃内酰胺Ⅰ
马兜铃酸Ⅰ
马兜铃酸Ⅱ
马兜铃酸Ⅲ
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马兜铃酸类为硝基菲类化合物，广泛存在于马兜铃科马兜铃属及细辛属植物中，具有肾毒性、致癌和致突变作用[1-2]。2000年WHO将马兜铃酸类列为Ⅰ类致癌物[3]。中国也相继采取了一系列措施来保证其临床用药安全，如先后禁止关木通、广防己、青木香的使用；对含有马兜铃、寻骨风、天仙藤和朱砂莲的中药制剂严格按处方药管理；要求细辛只能使用根及根茎入药[4-5]。2020年版《中国药典》中规定细辛中含马兜铃酸Ⅰ不得过0.01‰。再造丸是由蕲蛇肉、全蝎、细辛等五十八味中药组成的中药复方制剂，处方来源于《威信医方集》回天再造丸方加减，距今已有几百年的药用历史，具有祛风化痰、活血通络的功效，用于风痰阻络所致的中风，症见半身不遂、口舌歪斜、手足麻木、疼痛拘挛、言语謇涩。再造丸临床治疗脑血管病疗效确切[6-7]。再造丸处方中的细辛含有一定量的马兜铃酸类成分，目前暂无相关文献报道其中马兜铃酸类的研究。为保证再造丸的临床用药安全，明确其中是否含有马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ，建立了基于多反应监测的超高效液相色谱-串联质谱检测方法，以期为再造丸的安全性研究提供依据，同时也为其他含马兜铃酸类成分的中成药研究提供参考。

1、实验部分

1.1仪器与试药

1290-6460液-质联用仪（美国Agilent）。马兜铃酸Ⅰ对照品（中国食品药品检定研究院，批号：110746-201912，纯度：99.1%）；马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ对照品（成都普思科技股份有限公司，纯度分别为：98.0%、95.0%、98.0%);5批再造丸样品（市售，A企业3批、B企业2批）；甲醇、甲酸铵、甲酸为色谱纯；水为超纯水；其余试剂为分析纯。

1.2方法与结果

1.2.1溶液的制备

分别精密称取适量马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ对照品，分别置250mL量瓶中，用70%甲醇溶解并定容，配成浓度约为10μg·mL-1的单一对照品贮备液。根据各化合在仪器上的响应，分别精密吸取适量上述对照品贮备液，用70%甲醇制成马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ浓度分别为470、1051、969、549ng·mL-1的混合对照品工作液。取9g再造丸，加4.5g硅藻土，研细，取1.5g精密称定，置150mL具塞锥形瓶中，加入25mL70%甲醇，密塞，称定重量，超声处理30min，取出，冷却至室温，再称重，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。取处方中除细辛的其他药味，按处方比例制成缺细辛的阴性对照样品，同供试品制备方法制备缺细辛的阴性溶液。

1.2.2色谱条件与系统适用性的试验

采用WatersAcquityBEHUPLCC18色谱柱（100mm×2.1mm,1.7μm），流动相A为甲醇、流动相B为0.1%甲酸溶液（含5mmol·L-1甲酸铵），梯度洗脱（0～5min、30%～50%A,5～10min、50%～70%A,10～13min、70%A,13～13.5min、70%～30%A,13.5～15min、30%A），进样量1μL，流速0.3mL·min-1，柱温35℃。质谱采用电喷雾离子源（ESI源），扫描方式为正离子模式，多反应监测（MRM），毛细管电压3.5kV，干燥气温度325℃，鞘气温度350℃，干燥气流量8L·min-1，鞘气流量11L·min-1。4种马兜铃酸类成分的离子信息见表1。分别取混合对照品、供试品、阴性溶液，按上述色谱条件，进样测定。结果供试品色谱图中，在与混合对照品色谱图保留时间相同的位置上，有相应色谱峰，而阴性溶液的色谱图中无相应色谱峰。说明处方中其他药味对测定结果无干扰（图1）。

表1 4种马兜铃酸类成分的质谱参数

图1混合对照品（A）、阴性样品（B）、供试品（C）溶液的TIC及MRM色谱图

1.2.3线性关系、检出限和定量限的考察

精密吸取适量“1.2.1”项混合对照品工作液，用70%甲醇制成相应浓度的系列混合对照品溶液，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定，以浓度（ng·mL-1）为横坐标、响应为纵坐标，绘制标准曲线，各化合物在各自的浓度范围内r均大于0.9990。以信噪比约为3和10分别计算4种马兜铃酸类成分的检出限和定量限（表2）。

1.2.4加样回收率的试验

取15g已知含量的样品，加7.5g硅藻土，研细，取1.5g精密称定，平行操作6份，分别置150mL具塞锥形瓶中，各精密加入0.15mL混合对照品工作液，按“1.2.1”项方法制备加样回收溶液，按“1.2.2”项色谱条件，进样测定，计算得4种化合物的平均回收率为88.4%～102.5%,RSD为0.83%～3.87%(n=6）（表3）。

表2 4种化合物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限

表3加样回收率和基质效应的结果（ng,n=6)

1.2.5精密度、稳定性与重复性的试验

用70%甲醇配制一定浓度的混合对照品溶液，连续测定6次，记录峰面积，计算得4种化合物的RSD均小于5%，表明仪器的精密度良好。取加样回收溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24h时，进样测定，记录峰面积，计算得马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ、马兜铃内酰胺Ⅰ峰面积的RSD分别为1.95%、2.03%、3.05%、2.74%，表明所测化合物在24h内的稳定性良好。取A1样品，按“1.2.1”项方法制备重复性样品溶液，平行操作6份，进样测定，结果均未检出马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ，检出马兜铃内酰胺Ⅰ，平均含量为0.123μg·g-1，计算得其含量的RSD=2.47%，表明方法的重复性良好。

1.2.6样品含量的测定

取5批再造丸样品，按“1.2.1”项方法制备供试品溶液，平行操作2份，按“1.2.1”项色谱条件，进样测定。5批样品中均未检出马兜铃酸Ⅰ、马兜铃酸Ⅱ、马兜铃酸Ⅲ；A1～A3样品中马兜铃内酰胺Ⅰ的含量分别为0.123、0.086、0.080μg·g-1,B1～B2样品中马兜铃内酰胺Ⅰ的含量分别为0.112、0.127μg·g-1。

2、讨论

曾考察样品匀化（不添加硅藻土、样品-硅藻土1:0.5、样品-硅藻土1:1）、提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇）、料液比（25、50倍料液比）、提取方式及时间（超声15、30、60min，回流30、60min）对4种成分含量的影响，最终选择了文中的最佳前处理条件。还曾以甲醇、乙腈作有机相，以相同梯度考察4种成分在不同流动相中的保留和响应。4种成分在甲醇体系中的响应优于乙腈体系，且甲醇体系能够将马兜铃内酰胺Ⅰ与干扰峰完全分离。采用空白基质与纯溶剂中对照品峰面积的比值来评价再造丸中4种马兜铃酸类成分的基质效应。结果4种成分的基质效应均小于1.10。细辛具有解表散寒、祛风止痛的功效，广泛应用于各类中成药中，据不完全统计，处方中含细辛的中成药多达200余种。根据细辛在制剂中发挥药效不同，采用提取挥发油、煎煮、研磨成细粉等工艺入药。在安全性监管时，应根据细辛入药的提取工艺，有针对性地制定重点监管指标。如以细辛挥发油入药的应重点监测黄樟醚、甲基丁香酚等容易引起肝损伤的指标，以煎煮和细粉入药的应重点监测马兜铃酸类容易引起肾功能损伤的成分。同时，有关部门在制定相关中成药中马兜铃酸类成分的限量时，不仅要检测其中马兜铃酸类成分的含量，还应该考虑其每日服用量，以达到科学、准确、高效监管的目的。

参考文献:

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[4]马临科,王娟娟,郑成.HPLC-MS/MS测定鱼腥草和复方鱼腥草合剂中马兜铃酸类化合物含量[J].中国现代应用药学,2022,39(15):2011-2015.

[5]梁晟,杨青,李瑞莲,等.UPLC-MS/MS法测定13种中成药中的马兜铃酸A[J].华西药学杂志,2020,35(1):78-81.

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[7]翟建英,陈霞,靳冉,等.同仁再造丸抗脑缺血效应机制研究[J].中医药导报,2016,22(2):32-36.

基金资助:国家药典委员会“含细辛中成药标准修订”资助项目(2021Z16);

文章来源:何成军,王颖,陈芳毅,等.UPLC-MS/MS法测定再造丸中的4种马兜铃酸类成分[J].华西药学杂志,2024,39(04):456-459.