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氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌氧化应激性损伤的影响

2024-12-10 96 上传者：管理员

摘要：目的考察氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌氧化应激性损伤的影响。方法将大鼠分为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组。对照组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl;低、中、高剂量实验组分别灌胃0.3、0.6和1.2 mg·kg-1氢溴酸樟柳碱溶液。5组大鼠均连续给药4周。除对照组之外，其他4组大鼠给药2 h后，用负重力竭游泳运动构建运动性疲劳大鼠模型，共造模4周。用微量法检测血清乳酸脱氢酶（LDH）水平，用TUNEL染色法评价心肌细胞凋亡情况，用微量法检测心肌组织超氧化物歧化酶（SOD）活性，用蛋白质印迹法检测心肌组织中细胞核核因子E2相关因子2（Nrf2）蛋白的相对表达水平。结果对照组、模型组和低、中和高剂量实验组的血清LDH水平分别为（991.79±123.88）、（2 983.06±281.28）、（2 309.06±271.81）、（1 856.17±214.16）和（1 380.29±189.81） U·L-1,心肌TUNEL阳性率分别为（5.09±0.42）%、（48.43±5.57）%、（30.97±3.43）%、（21.57±2.31）%和（9.49±1.36）%,心肌SOD活性分别为（102.06±8.96）、（59.65±7.66）、（73.25±7.60）、（80.78±6.22）和（84.76±8.94） U·mg prot-1,细胞核Nrf2蛋白相对表达水平分别为1.00±0.08、0.31±0.03、0.60±0.05、0.89±0.06和1.21±0.09。模型组的上述指标与对照组比较，低、中、高剂量实验组的上述指标与模型组比较，在统计学上差异均有统计学意义（均P<0.05）。结论氢溴酸樟柳碱能够减轻运动性疲劳大鼠心肌氧化应激性损伤和细胞凋亡，其机制与激活Nrf2介导的抗氧化途径有关。

关键词：
ROS
氢溴酸樟柳碱
氧化应激
细胞凋亡
运动性疲劳
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超负荷运动中的高耗氧量诱导线粒体大量产生活性氧(reactive oxygen species, ROS),ROS无法被抗氧化系统有效清除就会引起氧化应激和线粒体依赖性细胞凋亡，从而损伤心脏功能。核因子E2相关因子2(nuclear factor E2 related factor 2,Nrf2)是调控抗氧化系统的中枢转录因子，运动性疲劳中的心肌氧化应激性损伤与Nrf2的转录抑制有关[1]。氢溴酸樟柳碱具有抗凋亡作用和抗氧化作用，尤其是在治疗脑缺血方面。由于超负荷运动会导致心肌供氧和供血不足，这与脑缺血病理机制存在一定的相似性。本研究旨在从抗氧化和抗细胞凋亡2个角度探讨氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌氧化应激损伤的影响，以期为抗运动性疲劳的天然药物研发提供候选药物。

一、材料与方法

1 材料

动物雄性SPF级SD大鼠，鼠龄7周，体质量320～350 g, 北京安凯毅博生物技术有限公司提供。动物生产许可证号：SCXK(京)2023-0002。动物使用许可证号：SYXK(皖)2023-015。本研究经淮北师范大学科学伦理委员会批准(伦理批号：KY2023N011)。

药品与试剂氢溴酸樟柳碱，规格：每瓶20 mg, 纯度：高效液相色谱≥98%,批号：D2137,上海宝曼生物科技有限公司生产。乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、肌酸激酶(creatine kinase, CK)、心肌肌钙蛋白Ⅰ(cardiac troponin Ⅰ,cTn Ⅰ)、苏木精-伊红(hematoxylin eosin, HE)染色试剂、TUNEL染色试剂、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；PrimerScript RT试剂盒、SYBR Green Master Kit, 均购自日本TaKaRa公司；Nrf2一抗、Lamin B1一抗、山羊抗兔免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG) H&L二抗，均购自英国Abcam公司。

仪器VEVO 3100小动物超声影像系统，加拿大VisualSonics公司产品；BX63共聚焦显微镜，日本Olympus Corporation公司产品；NanoDrop 2000分光光度计，美国Thermofisher公司产品；7500实时荧光定量聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)仪，美国ABI公司产品。

2 实验方法

2.1 模型构建[2]

用负重力竭游泳运动的方法构建运动性疲劳大鼠模型。负重力竭游泳运动方案如下：大鼠称质量，并分别制备大鼠5%体质量的铅坠，将铅坠系于大鼠尾根部，然后将大鼠放入直径50 cm的水槽中游泳至力竭，游泳期间维持水深50 cm, 水温30 ℃。每天游泳2次，间隔6 h。每周游泳5 d, 共游泳4周。

2.2 动物分组与给药方法[3]

将大鼠分为对照组、模型组和低、中、高剂量实验组，每组20只。对照组和模型组均灌胃等量0.9%NaCl。低、中、高剂量实验组大鼠分别灌胃0.3、0.6和1.2 mg·kg-1·d-1氢溴酸樟柳碱。各组均连续给药4周，除对照组外，其他各组给药2 h后按“2.1”的方法进行造模。

2.3 小动物超声影像系统检测大鼠心功能参数[4]

用小动物超声影像系统检测大鼠左心室射血分数(left ventricular ejection fraction, LVEF)、左心室舒张末期内径(left ventricular end diastolic diameter, LVIDd)和左心室收缩末期内径(left ventricular end systolic diameter, LVIDs)。

2.4 微量法和酶联免疫吸附试验法检测血清心肌损伤指标[5]

收集大鼠腹主动脉血，在4 ℃下，以3 000 r·min-1离心10 min, 取血清。按试剂盒说明书的方法进行操作，用微量法检测LDH和CK水平，用ELISA法检测cTn Ⅰ水平。

2.5 HE和TUNEL染色法观察心肌组织[6]

无菌分离大鼠心脏，4%多聚甲醛固定24 h后石蜡包埋，用切片机切成4 μm厚切片。将切片用二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，然后按试剂盒说明书的步骤进行HE和TUNEL染色，在显微镜下观察并拍照。

2.6 微量法检测心肌组织氧化应激指标[7]

将大鼠心肌组织与提取液混合，用玻璃匀浆器匀浆，在4 ℃下，以8 000 r·min-1离心10 min, 取上清液。按试剂盒说明书的方法进行操作，用微量法检测SOD、CAT和MDA水平。

2.7 RT-PCR法检测心肌B淋巴细胞瘤-2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X,Bax)、血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)和NAD(P)H:醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1,NQO1]mRNA相对表达水平[8]

用TRIzol试剂提取心肌总RNA,用分光光度法检测纯度。用逆转录试剂盒合成cDNA。用SYBR Green Master Kit在PCR仪上进行扩增。扩增条件为：95 ℃ 5 min, 95 ℃ 20 s, 62 ℃ 20 s, 72 ℃ 10 s, 40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参基因，用2-ΔΔCt方法计算基因相对表达水平。

2.8 蛋白质印迹法检测心肌组织中细胞核Nrf2蛋白的相对表达水平[9]

用蛋白抽提试剂盒提取心肌总蛋白，将蛋白在10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳并电转移到PVDF膜。5%脱脂牛奶封闭2 h, 将膜与Nrf2和Lamin B1一抗4 ℃孵育过夜。然后与IgG H&L二抗室温孵育2 h, 抗体稀释度均为1∶1 000稀释。ECL显色后，用Image Lab 4.1软件分析灰度值。Lamin B1作为细胞核蛋白内参。

3 统计学处理

用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，组间比较用单因素方差分析和LSD检验。

二、结果

1 氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心功能参数的影响

对照组和模型组均给予等量0.9%NaCl; 低、中、高剂量实验组分别给予0.3、0.6和1.2 mg·kg-1·d-1氢溴酸樟柳碱。

模型组与对照组比较，LVEF显著降低，LVIDd和LVIDs均显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，LVEF均显著升高，LVIDd和LVIDs均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且成剂量依赖性，见表1。

2 氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌损伤的影响

对照组心肌结构正常，心肌纤维排列有序，无炎性细胞浸润。模型组心肌出现明显的心肌细胞肿胀、变形、水肿，伴有广泛炎性细胞浸润。低、中、高剂量实验组与模型组比较，心肌损伤均显著减轻。结果见图1。

表1各组大鼠心功能参数的比较

图1各组大鼠的心肌组织苏木精-伊红(HE)染色图像(×200)

表2各组大鼠血清心肌损伤指标水平的比较

模型组与对照组比较，血清LDH、CK和cTn Ⅰ水平均显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，血清LDH、CK和cTn Ⅰ水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且成剂量依赖性，见表2。

3 氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌细胞凋亡的影响

模型组与对照组比较，心肌组织TUNEL阳性率和BaxmRNA相对表达水平均显著升高，Bcl-2 mRNA相对表达水平显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，心肌组织TUNEL阳性率和BaxmRNA相对表达水平均显著降低，Bcl-2 mRNA相对表达水平均显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且成剂量依赖性，见表3。

4 氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌组织氧化应激指标的影响

模型组与对照组比较，心肌组织中SOD和CAT水平均显著降低，MDA水平显著升高，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，心肌组织中SOD和CAT水平均显著升高，MDA水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),且成剂量依赖性，见表4。

表3各组大鼠心肌组织TUNEL阳性率和B淋巴细胞瘤-2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax) mRNA相对表达水平的比较

5 氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌组织Nrf2途径的影响

模型组与对照组比较，心肌组织细胞核Nrf2蛋白和HO-1、NQO-1 mRNA相对表达水平均显著降低，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);低、中、高剂量实验组与模型组比较，心肌组织细胞核Nrf2蛋白和HO-1、NQO-1 mRNA相对表达水平均显著升高(均P<0.05),且成剂量依赖性，见表5。

表4各组大鼠心肌组织氧化应激指标水平的比较

表5各组大鼠心肌组织细胞核核因子E2相关因子2(Nrf2)蛋白和血红素氧合酶1(HO-1)、

三、讨论

细胞凋亡是运动诱导心肌损伤的主要机制[10]。超负荷运动会引起线粒体功能障碍，从而激发线粒体依赖性细胞凋亡[11]。本研究结果表明，氢溴酸樟柳碱减轻了运动性疲劳大鼠的心肌细胞凋亡。研究表明，氢溴酸樟柳碱(0.3和0.6 mg·kg-1)可促进慢性脑低灌注大鼠Bcl-2蛋白的表达并下调Bax蛋白的表达[12],与本研究结果基本一致。本研究结果表明，氢溴酸樟柳碱提高了运动性疲劳大鼠的心肌抗氧化活性。

本研究结果表明，氢溴酸樟柳碱促进了运动性疲劳大鼠心肌组织Nrf2的细胞核易位，并上调了HO-1和NQO-1的转录活性。当受到内部或外部氧化剂刺激后，细胞会启动Nrf2途径介导的抗氧化防御系统以应对氧化应激。Nrf2通常与其抑制物Kelch样ECH相关蛋白1(Kelch-like ECH associated protein 1,Keap1)以无活性形式结合在细胞质中，激活后Nrf2从Keap1解离并发生细胞核易位，在细胞核中与HO-1、NQO-1等抗氧化基因的抗氧化反应元件结合并调控其转录活性。因此，通过激活Nrf2可以有效减轻超负荷运动引起的心肌氧化应激性损伤。这些结果说明氢溴酸樟柳碱减轻心肌氧化应激性损伤的机制与激活Nrf2介导的抗氧化途径有关。

本研究提示，氢溴酸樟柳碱减轻了运动性疲劳大鼠心肌氧化应激性损伤和细胞凋亡，其机制与激活Nrf2介导的抗氧化途径有关。本研究认为氢溴酸樟柳碱具有心肌保护作用，尤其是在防治运动性心脏损伤方面，具有较高的开发潜力。

参考文献:

[2]尹瑞欣,白江涛,张晓红,等.补阳还五汤对运动性疲劳大鼠抗氧化酶活性的影响 [J].广东医学,2015,36(10):1487—1489.

[4]冯婉蓉,白兰,宋倩男,等.异甘草素对心肌梗死大鼠诱导的室性心律失常及炎症因子的影响 [J].国际免疫学杂志,2023,46(3):246—251.

[5]董佳萍,谢琳琳,王鹤霖,等.金雀异黄素通过AMPK/SIRT1/PGC-1α信号通路缓解免疫抑制大鼠的疲劳作用 [J].食品科学,2023,44(9):82—87.

[6]李睿,王祎昕,纪树亮,等.大鼠心肌缺血再灌注损伤模型改良置管法 [J].中国病理生理杂志,2022,38(10):1913—1920.

[7]刘志伟,刘鹏,孟凡星,等.内源性二氧化硫对脓毒症大鼠心肌氧化应激的调节 [J].北京大学学报(医学版),2023,55(4):582—586.

[8]陈龙,田焕娜,高玉峰.生黄合剂对缺血再灌注模型大鼠心肌细胞凋亡及相关基因bax､bcl-2 mRNA的影响 [J].中国组织工程研究,2016,20(27):4049—4054.

[9]杨昊若,任军华,张昱,等.槲皮素通过激活Keap1/Nrf2信号通路减轻脂多糖诱导的大鼠急性肾损伤[J].中国临床药理学杂志,2023,39(21):3134—3138.

基金资助:安徽省高校人文社科研究基金资助项目(SK2020A0980);

文章来源:王训令,邱雷,孙慧.氢溴酸樟柳碱对运动性疲劳大鼠心肌氧化应激性损伤的影响[J].中国临床药理学杂志,2024,40(23):3434-3438.