急性肝衰竭(acute hepatic failure, ALF)是由药物、毒素或病毒引起的肝功能严重损害导致的死亡率和发病率较高的一种疾病，其特征是短期肝坏死、细胞凋亡和肝再生失败[1]。由于肝移植可能是治愈ALF的唯一途径方法，因此迫切需要寻找新的治疗策略。研究表明，骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSCs)治疗可以改善肝功能，可在一定程度上提高肝功能衰竭患者的生存率[2],但其潜在作用机制仍不十分明确。此外，已有研究证实组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)抑制药CAY10683在ALF中具有一定的保护作用[3]。本研究通过构建体外ALF细胞模型，旨在探讨CAY10683联合MSCs对ALF是否具有协同作用，并深入探究其作用机制。

一、材料与方法

1 材料

细胞MSCs, 购自美国ATCC公司；人正常肝细胞L-02,购自上海雅吉生物科技有限公司。

药物与试剂HDAC抑制药CAY10683,规格：每瓶1 kg, 纯度：99%,批号：240315,湖北实顺生物科技有限公司生产。杜氏改良Eagle培养基(Dulbecco’s modification of Eagle’s medium, DMEM),上海户实医药科技有限公司生产；D氨基半乳糖胺(D-galactosamine,D-GalN),美国Sigma公司生产；细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8, CCK-8)、Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒、JC-1线粒体膜电位试剂盒，均购自北京索莱宝科技有限公司；谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase, GOT)、谷丙转氨酶(glutamic-pyruvic transaminase, GPT)试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所；TRIzol试剂、逆转录试剂盒，均购自上海爱必信生物公司；兔自噬相关的微管相关蛋白1轻链3Ⅱ型(microtubule associated protein 1 light chain 3 Ⅱ,LC3 Ⅱ)、LC3 Ⅰ、Beclin1、SQSTM1蛋白(sequestosome 1,p62)、组织蛋白酶 B(cathepsin B, CTSB)、溶酶体关联膜蛋白 1(lysosomal associated membrane protein 1, LAMP1)、葡萄糖调节蛋白(glucose regulated protein 75,Grp75)一抗、山羊抗小鼠免疫球蛋白 G(immunoglobulin G,IgG)H&L(DyLight®550)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor®488),均购自美国Abcam公司；活性氧(reactive oxygen species, ROS)检测试剂盒，购自上海碧云天生物公司；引物，均由上海碧云天生物公司合成。

仪器SpectraMax iD3多功能酶标仪，奥地利Molecular Devices公司产品；FV1200双扫描激光共聚焦显微镜，日本奥林巴斯公司产品；eQ162C实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)检测系统，苏州东胜兴业科学仪器有限公司产品。

2 实验方法

2.1 细胞培养[4-5]

MSCs细胞和L-02细胞均培养在DMEM培养基中(含有10%胎牛血清和1%青链霉素),置于培养箱(37 ℃,5%CO2)中培养，根据生长情况每隔1～2 d更换1次培养液，待细胞培养至85%时进行消化传代。

2.2 模型构建、细胞分组与处置方法

将L-02细胞随机分为正常组、模型组、MSCs组、CAY10683组和联合组。正常组细胞为正常培养的L-02细胞，除正常组外其余各组细胞均用30 mmol·L-1D-GalN联合1 μg·mL-1LPS干预24 h诱导急性肝细胞损伤模型[6],其中MSCs组细胞造模后将L-02细胞与MSCs以1∶5的比例共培养24 h, CAY10683组细胞造模后用5 μmol·L-1HDAC抑制药CAY10683处理细胞24 h, 联合组细胞造模后将L-02细胞与MSCs共培养并加入5 μmol·L-1CAY10683处理细胞24 h。

2.3 CCK-8实验检测细胞存活率[7]

收集各组处理结束后的L-02细胞，每孔加入CCK-8试剂10 μL置于培养箱继续培养2 h后用酶标仪检测光密度值(450 nm),计算细胞存活率。细胞存活率=(药物组光密度值-空白组光密度值)/(正常组光密度值-空白组光密度值)×100%。

2.4 RT-qPCR检测mRNA相对表达情况[8]

收集处理后的各组L-02细胞，用TRIzol法提取总RNA,逆转录为模板DNA后进行qPCR扩增(95 ℃,5 min预变性；95 ℃,15 s变性；60 ℃,15 s退火；72 ℃,34 s延伸，45循环);以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)为内参，用2-ΔΔCt法计算细胞核相关抗原Ki67(nuclear associated antigen Ki67,Ki67)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、IL-1β、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)mRNA相对表达水平。

2.5 流式细胞术检测细胞凋亡情况[7]

收集处理后的各组L-02细胞，以1 500 r·min-1离心5 min后弃上清液，加入磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS)混匀细胞后离心弃上清液，重新加入PBS 200 μL重悬细胞，再加入Annexin V-FITC 5 μL和PI试剂5 μL,混匀后孵育30 min, 用流式细胞术仪检测。

2.6 试剂盒法检测细胞GOT、GPT水平[6]

收集各组细胞，离心(3 500 r·min-1,15 min)后取上清液，然后严格根据试剂盒操作步骤检测细胞GOT、GPT表达水平。

2.7 JC-1实验检测细胞线粒体膜电位[9]

收集处理后的L-02细胞，根据试剂盒说明加入适量的JC-1工作液混匀后培养箱孵育30 min, 然后PBS清洗后用荧光显微镜观察红、绿荧光强度比值。

2.8 免疫荧光检测LC3B与线粒体共定位[10]

收集处理后的各组L-02细胞，PBS清洗，对细胞固定(甲醛)后用封闭液室温封闭20 min, 然后加入小鼠抗LC3B(1∶200)、兔抗Grp75(1∶500)一抗进行孵育过夜，次日去除一抗，PBS清洗后滴加对应种属的荧光二抗[山羊抗小鼠IgG H&L(DyLight®550)、山羊抗兔IgG H&L(Alexa Fluor®488)](1∶200)孵育2 h, 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)进行核染后封片，用激光共聚焦显微镜观察。

2.9 蛋白质印迹法实验检测细胞蛋白相对表达情况[9]

收集处理后的L-02细胞，裂解细胞收集细胞蛋白提取物，BCA方法定量，取适量的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳，转至PVDF膜，然后加入一抗，4 ℃下孵育过夜，次日洗膜后加入二抗稀释液在暗处孵育2 h, 洗膜后滴加ECL化学发光液，曝光后分析灰度值。

2.10 试剂盒法检测细胞ROS水平[8]

收集各组L-02细胞，PBS洗涤后用DCFH-DA荧光探针(10 μmol·L-1,1 mL)孵育20 min, 清洗细胞后，用荧光显微镜观察。

3 统计学方法

用SPSS 23.0软件进行统计分析。计量资料以

表示，多组间比较用单因素方差分析，进一步两两比较用LSD-t检验。

二、结果

1 各组L-02细胞增殖情况的比较

将L-02细胞随机分为正常组(正常培养的细胞)、模型组(40 mmol·L-1D-GalN+1 μg·mL-1LPS干预)、MSCs组(D-GalN/LPS诱导，并与MSCs共培养)、CAY10683组(D-GalN/LPS+5 μmol·L-1CAY10683)、联合组(D-GalN/LPS+5 μmol·L-1CAY10683处理，并与MSCs共培养)。

模型组细胞存活率、凋亡率、Bax、Bcl-2、Ki67、PCNAmRNA相对表达水平与正常组、MSCs组、CAY10683组和联合组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05);联合组细胞存活率、凋亡率、Bax、Bcl-2、Ki67、PCNAmRNA相对表达水平分别与MSCs组、CAY10683组比较，在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05),见表1。

2 CAY10683联合MSCs对L-02细胞GOT、GPT及炎性细胞因子表达的影响

模型组细胞GOT、GPT及炎性因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)mRNA水平较正常组均显著升高(均P<0.05);MSCs组、CAY10683组、联合组与模型组比较，细胞GOT、GPT及炎性因子mRNA水平均显著降低(均P<0.05);联合组细胞GOT、GPT及炎性因子mRNA水平均分别较MSCs组、CAY10683组显著降低(均P<0.05),见表2。

3 CAY10683联合MSCs对L-02细胞线粒体功能的影响

正常组、模型组、MSCs组、CAY10683组、联合组细胞线粒体膜电位红/绿荧光比分别为1.00±0.06、0.51±0.05、0.73±0.04、0.71±0.08和0.87±0.11。模型组线粒体膜电位较正常组显著降低(P<0.05);MSCs组、CAY10683组、联合组线粒体膜电位较模型组均显著升高，且联合组线粒体膜电位均显著高于MSCs组、CAY10683组(均P<0.05)。

4 CAY10683联合MSCs对L-02细胞线粒体自噬的影响

细胞免疫荧光共定位检测LC3B与线粒体共定位情况，Grp75标记线粒体显示绿色荧光，LC3B被标记为红色荧光，DAPI标记细胞核显示蓝色荧光，模型组细胞共定位的黄色荧光强度较正常组明显减弱，MSCs组、CAY10683组、联合组细胞黄色荧光强度较模型组均增强，其中联合组的黄色荧光强度最强，见图1。模型组细胞LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin-1蛋白相对表达水平较正常组均显著降低，p62蛋白相对表达水平显著升高(均P<0.05);MSCs组、CAY10683组、联合组与模型组比较，细胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1蛋白相对表达水平均显著升高，p62蛋白相对表达水平均显著降低(均P<0.05),联合组细胞LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1蛋白相对表达水平分别较MSCs组、CAY10683组均显著升高，p62蛋白相对表达水平均显著下降(均P<0.05),见表3。

表1各组细胞存活率、凋亡率及相关基因表达的比较

表2各组细胞GOT、GPT及炎性因子 mRNA表达的比较

图1各组细胞中微管相关蛋白1轻链3B(LC3B)与线粒体共定位的免疫荧光图(激光共聚焦显微镜，×400)

表3各组细胞线粒体自噬相关蛋白表达的比较

模型组细胞ROS水平、CTSB蛋白相对表达水平较正常组均显著升高，LAMP1水平显著降低(均P<0.05);MSCs组、CAY10683组、联合组与模型组比较，细胞ROS水平、CTSB蛋白相对表达水平均显著降低，LAMP1水平均显著升高(均P<0.05);联合组ROS水平、CTSB蛋白相对表达水平分别较MSCs组、CAY10683组均显著降低，LAMP1水平均显著升高(均P<0.05),见表4。

表4各组ROS水平及LMP相关蛋白表达水平的比较

三、讨论

在过去的几十年中，包括MSCs在内的多种干细胞已被用于治疗ALF,其中由于不存在伦理挑战，而且比较容易获得，MSCs是在ALF中研究最多的干细胞[11]。最近，多项研究集中于MSCs与其他治疗方式联合治疗改善ALF,这种治疗方式在减轻肝细胞凋亡，促进肝组织再生上具有协同作用[12]。研究表明，HDAC抑制药CAY10683可通过抑制线粒体凋亡途径减少细胞凋亡对ALF起到保护作用[3,13]。本研究用D-GalN联合LPS构建ALF细胞模型，用CAY10683、MSCs处理细胞后，发现L-02细胞存活率均显著提高，凋亡率降低，CAY10683与MSCs联合处理后对细胞存活率及促增殖因子Ki67、PCNA的诱导作用均优于其单独处理，对细胞凋亡率和Bax表达的抑制作用及对Bcl-2表达的诱导作用均强于单独处理组；此外，CAY10683与MSCs联合处理对细胞中肝损伤标志物GOT、GPT及炎性因子表达的抑制作用明显强于单独处理组，这提示CAY10683与MSCs联合治疗可进一步促进ALF肝细胞增殖，并加强对肝细胞凋亡和炎症的抑制作用，进而在改善ALF中发挥协同作用。

线粒体功能障碍是包括ALF在内的多种疾病的诱发因素，线粒体膜电位的降低是线粒体受损的重要标志，在本研究中D-GalN联合LPS刺激L-02细胞后，细胞线粒体膜电位显著降低，提示L-02细胞线粒体功能受损，而CAY10683联合MSCs处理后，细胞线粒体膜电位显著升高，且升高程度明显高于单独处理组，这提示CAY10683联合MSCs可通过显著改善线粒体功能障碍在保护ALF中发挥协同作用。胡喻[14]研究表明，MSCs联合中成药物可通过促进线粒体自噬有效维持线粒体功能对ALF起到保护作用。在本研究中观察到，CAY10683、MSCs单独处理细胞后，LC3B与线粒体共定位数量明显增多，CAY10683联合MSCs处理后LC3B与线粒体共定位数量较单独处理组进一步增多；此外，二者联合作用细胞后，诱导自噬相关蛋白LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ、Beclin-1水平较单独处理组均明显上调，而抑制自噬蛋白p62水平明显下调；这提示CAY10683联合MSCs可通过促进线粒体自噬，清除D-GalN/LPS诱导的受损线粒体，维持线粒体功能进而改善ALF,这与胡喻[14]的研究结果一致。

LMP的发生是诱导细胞发生死亡的关键阶段之一，线粒体功能发生障碍可导致大量ROS积累，而ROS是引起LMP的重要因素之一；破坏膜完整性使得溶酶体内酶渗漏到细胞质中是LMP的典型特征，CTSB的释放和溶酶体膜蛋白LAMP1的降解是LMP的标志性指标[15]。本研究中观察到CAY10683联合MSCs处理后，L-02细胞中LAMP1水平较单独处理组明显提高，CTSB表达和ROS水平均明显降低，这提示，CAY10683联合MSCs可能通过线粒体自噬-ROS-LMP通路缓解LAF进展。

本研究结果表明，CAY10683与MSCs联合作用，可能通过促进线粒体自噬，介导线粒体-ROS-LMP途径，抑制D-GalN/LPS诱导的L-02细胞凋亡，在保护ALF中起协同作用。

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基金资助:福州市科技计划基金资助项目(2023-S-001);

文章来源:陈丽霞,林建辉,陈敏,等.HDAC抑制药联合骨髓间充质干细胞对急性肝细胞损伤的保护作用[J].中国临床药理学杂志,2024,40(24):3595-3600.