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RP-HPLC法同时测定4种抗癫痫药物血清浓度研究

2020-09-30 179 上传者：管理员

摘要：目的：建立反相高效液相色谱（RP-HPLC）法，同时测定拉莫三嗪（LTG）、奥卡西平（MHD）、苯妥英钠（PHT）和卡马西平（CBZ)4种抗癫痫药物的血清浓度。方法：选用纯甲醇为萃取溶剂，以WaterssunfineC18柱为分离色谱柱，甲醇-水（40∶60）为流动相，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长235nm。结果：LTG、MHD、PHT和CBZ分离良好，线性范围分别为0.8～31.0、1.39～47.94、1.19～38.34、0.99～31.01μg/mL；血清最低检测浓度分别为0.02、0.27、0.47、0.05μg/mL；总平均回收率分别为99.97%、100.81%、99.74%、99.59%；日内精密度均小于3.00%，日间精密度均小于5.00%。结论：RP-HPLC法稳定性好，经济简便，适用于临床联合使用抗癫痫药物的血药浓度监测。

关键词：
反相高效液相色谱
抗癫痫药物
精密度
血药浓度
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拉莫三嗪（LTG）、奥卡西平（OXC）、苯妥英钠（PHT）和卡马西平（CBZ）均为临床常用的一线抗癫痫药物。临床对于癫痫的控制与治疗多采用单一给药方式，但是对于难治性癫痫常采取联合给药方式，此类药物在人体内药代动力学机制复杂，不同个体或同一个体在不同阶段服用后，其血药浓度存在明显差异[1]，且其疗效及不良反应与血药浓度密切相关。本文采取反相高效液相色谱（RP-HPLC）法同时测定以上4种药物的血清浓度，为临床个体化用药提供依据，以提高药物疗效，降低不良反应发生率[2]。

1、材料与方法

1.1仪器与试剂

高效液相色谱（HPLC）仪（美国Waters公司，包括1500系列HPLC泵、2489紫外检测器、2414示差检测器、2998二极管矩阵检测器、717plus自动进样器、1500柱温箱），MX-S旋涡混合器（北京大龙仪器公司），HC-2062高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。LTG、OXC、PHT、CBZ标准品（中国药品生物制品检定所），甲醇为色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司），去离子水，空白血清（取自本院健康体检者）。

1.2方法

1.2.1色谱条件

色谱柱：WaterssunfineC18色谱柱（4.6mm×250.0mm,5μm）；流动相：甲醇-水（40∶60）；流速：1.0mL/min；检测波长：235nm；柱温：35℃；进样量：60μL。

1.2.2标准溶液的配制

精密称取LTG、MHD、PHT和CBZ的标准品适量，分别用甲醇定容至800、1000、800、800μg/mL，置于4℃冰箱冷藏保存。

1.2.3样品的处理

于1.5mL具塞尖底塑料离心管中加入空白血清200μL，加入LTG、MHD、PHT和CBZ的标准溶液各10μL，涡旋30s混匀后加入600μL甲醇沉淀蛋白，涡旋震荡2min,10000r/min离心5min，取上清液60μL进样。

2、结果

2.14种抗癫痫药物的色谱图

采用HPLC仪绘制的LTG、MHD、PHT和CBZ色谱图见图1。

图1LTG、MHD、PHT和CBZ色谱图

2.2标准曲线和检测限

于1.5mL尖底塑料离心管中分别加入LTG、MHD、PHT和CBZ标准溶液，用甲醇溶液稀释成6个浓度梯度，分别加入空白血清200μL，按1.2.3样品处理方法提取进样，得到各自的浓度（X）对其峰面积比值（Y）的线性回归方程，见表1。

表1LTG、MHD、PHT、CBZ线性关系

2.3回收率试验

配制分别含有LTG、MHD、PHT和CBZ低、中、高3个浓度的血清样品，参照1.2.3样品处理方法提取进样，计算相对标准偏差（RSD），见表2。血清中4种药物的总平均回收率分别为99.97%、100.81%、99.74%、99.59%。

2.4精密度试验

对上述低、中、高3个浓度的血清样本各配制3份，分别在同一天和连续的3d进行检测，得出日内精密度及日间精密度，如表2所示，4种样品的日内精密度均小于3.00%，日间精密度均小于5.00%，表明本法重现性好，结果较稳定。

表2LTG、MHD、PHT、CBZ回收率及精密度实验结果（n=3)

3、讨论

近年来，采用HPLC法检测药物的浓度在临床使用中逐渐普及，为患者个体化用药提供参考，但现有文献报道多是对单一药物的测定[3,4]，本研究采用RP-HPLC法对LTG、MHD、PHT和CBZ进行互为内标的检测，经紫外分光光度计扫描结果显示，4种药物在235nm均有较强的吸收峰，且分离效果良好。文献[5]报道样品预处理时使用二氯甲烷，因提取层在下层，不易吸取且操作麻烦。文献[6]报道用乙酸乙酯、石油醚等处理样品，操作步骤烦琐，所用试剂价格较昂贵。本法采用甲醇[7,8]直接沉淀蛋白，减少了提取液挥干等步骤，操作方便省时，比较适合临床对于常用抗癫痫药物的检测。本法所用的流动相为甲醇-水（40∶60），流动相呈中性，避免使用文献[9,10]中所用的磷酸盐、乙腈等对色谱柱及仪器损害较大的试剂，可以延长色谱柱的使用寿命。

LTG为广谱抗癫痫药物，主要通过阻断突触前膜电压敏感性钠离子通道，抑制谷氨酸和天冬氨酸的释放，发挥抗癫痫作用[11,12]。MHD是卡马西平的10-酮基衍生物[13]，在体内可迅速转化成活性代谢物10-羟基卡马西平发挥抗癫痫作用[14]。PHT能抑制细胞外Na+的被动内流，导致细胞膜稳定化，升高其兴奋阈值，阻止脑部异常电位活动向周围正常组织扩散，从而制止癫痫发作。CBZ可作用于神经细胞膜，减少钠离子和钙离子内流，抑制神经细胞兴奋，限制痫性放电，进而减少癫痫发作[15]。

MHD为肝药酶抑制剂，而PHT和CBZ均为肝药酶诱导剂，在联合使用抗癫痫药物时，应考虑几种药物联用时药代动力学的变化，所引起的药物不良更应该引起重视。血药浓度可以为临床医生提供参考，以免药物浓度降低或体内药物蓄积引起患者的不适，医生可根据患者的临床表现及血药浓度的高低为患者调整用药方案[16]，达到安全、有效、经济的合理用药目的。

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