丁基胶塞因具有吸湿率低、耐化学性及气密性好、无生理毒副作用等明显优于天然胶塞的性质，已广泛被药品生产企业采用。从市场信息来看，某些抗生素注射用粉针剂在贮存过程中，存在质量发生变化的突出现象，有文献报道此与所用胶塞有关，即认为胶塞与药物的相容性存在一定的问题[1,2,3]。研究指出，影响胶塞与药物相容性的往往不是胶塞的主要成分，而是胶塞中含量比较微量的助剂（如抗氧剂等）。国家食品药品监督管理局（CFDA）在2012年发布了《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则（试行）》[4]，本指导原则主要阐述了注射剂与塑料包装的相容性研究的基本思路和主要内容，对胶塞与药物粉末的相容性试验具有借鉴意义。2015年版《中华人民共和国药典》首次收录《药包材通用要求指导原则》，对药包材与药物相容性研究的内容进行了概述，相容性研究的内容主要包括提取试验、迁移试验和安全性试验。鉴于橡胶配方的复杂性，应重点考察其中各种添加物的溶出对药物的作用、橡胶对药物的吸附以及填充材料在溶液中的脱落[5,6]，游离硫和常见抗氧剂从胶塞中迁移至样品中[7,8,9,10]。为此，本研究参考相关文献，建立高效液相色谱法（HPLC）同时测定了药用丁基胶塞中游离硫、抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂3114的含量，以为其质量控制提供参考；并结合液相-质谱联用仪检测技术，分析全部批次的药用丁基胶塞中的BHT是否存在通过吸附、吸收、渗透和抽提等方式将抗氧剂迁移至药品中的情况，为进一步开展药包材与药物之间的相容性试验奠定基础。

1、材料

1.1仪器

Agilent1260型高效液相色谱仪（Agilent公司），LC-20ADXR/API4000+液相色谱质谱联用仪（ABSCIEX公司），BT124S万分之一电子天平（Sartorius公司），BT125D十万分之一电子天平（Sartorius公司），integral3超纯水仪（密理博公司）。

1.2包材与试剂

BHT（抗氧剂264,2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）对照品（批号AP170125-26，纯度99.93%，规格：250mg·瓶-1),StanfordAnalyticalChemicalsInc公司；游离硫对照品（批号106536，纯度99.0%，规格：0.25g·瓶-1),Dr.EhrenstorferGmbH公司；抗氧剂330[1,3,5-三甲基-2,4,6-三（3,5-二叔丁基-4-羟苄）苯]对照品（批号195007-201601，纯度99.6%，规格：50mg·支-1）、抗氧剂1010{四[β-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸]季戊四醇酯}对照品（批号195014-201601，纯度98.2%，规格：200mg·支-1）、抗氧剂1076[β-（3,5-二叔丁基-4-羟基苯基）丙酸十八碳醇酯]对照品（批号195009-201601，纯度99.5%，规格：50mg·支-1）、抗氧剂3114[1,3,5-三（3,5-二叔丁基-4-羟基苄基）异氰尿酸]对照品（批号195008-201601，纯度99.8%，规格：50mg·支-1），中国食品药品检定研究院。固相萃取小柱（批号B6081319，规格：WelchromBRP2g/12mL,20PK，以二乙烯基苯聚合物为填料），月旭公司；甲醇、无水乙醇、二氯甲烷、正己烷、丙酮为色谱纯，水为超纯水。

2、方法与结果

2.1色谱条件与系统适用性

色谱柱：SHIMADZUShim-packGISTC18色谱柱（5μm,4.6mm×250mm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填料；流动相：甲醇（A）-水（B），梯度洗脱（0～7min,95%A;7～15min,95%A→100%A;15～35min,100%A;35～40min,100%A→95%A）；流速：1.0mL·min-1；柱温：25℃；检测波长：220nm；进样量：10µL。在该色谱条件下，BHT、抗氧剂3114、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076峰的理论板数均大于2000，保留时间分别为5.835、11.285、13.066、17.986、19.259、29.085min；各成分峰之间分离良好，分离度均大于2.0，见图1。

图1混合对照品高效液相色谱图

2.2溶液的制备

2.2.1混合对照品溶液

分别精密称取BHT、抗氧剂3114、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076对照品各适量，置于同一100mL量瓶中，加入二氯甲烷5mL溶解并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得混合对照品储备液。精密吸取上述混合对照品储备液5mL，置25mL量瓶中，加无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得BHT、抗氧剂3114、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076质量浓度分别为0.02112、0.02102、0.02104、0.02146、0.02124、0.02106mg·mL-1的混合对照品溶液。

2.2.2供试品溶液

取药用卤化丁基胶塞样品剪碎，精密称取约2g，置于具塞锥形瓶中，加入无水乙醇-正己烷-丙酮（4∶3∶3)20mL，密塞，加热回流8h，放冷，再次称量，用无水乙醇-正己烷-丙酮（4∶3∶3）补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3空白对照溶液

以无水乙醇-正己烷-丙酮（4∶3∶3）为空白对照溶液。

2.3线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品储备液0.1、1、2、5、10mL，分别置于10mL量瓶中，加入无水乙醇稀释至刻度，摇匀，制成系列线性关系工作溶液。精密量取上述系列线性关系工作溶液各10µL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以各待测成分质量浓度（X，µg·mL-1）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，回归方程与线性范围见表1。

2.4定量下限与检测下限考察

分别精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，倍比稀释，按“2.1”项下色谱条件进样测定，分别以信噪比10∶l、3∶1计算定量下限、检测下限。结果见表1。

2.5精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。结果BHT、抗氧剂3114、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076峰面积的RSD(n=6）分别为0.14%、0.59%、0.34%、1.5%、0.27%、0.20%，表明仪器精密度良好。

表1回归方程与线性范围

2.6稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液（批号F181010901）适量，分别于室温下放置0、2、4、8、12、24、48h，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果BHT、游离硫、抗氧剂1076峰面积的RSD(n=6）分别为1.9%、1.8%、1.6%，其他成分未检出，表明供试品溶液在室温下放置48h内基本稳定。

2.7重复性试验

精密称取剪碎后的胶塞样品（批号F181010901）适量，共6份，按“2.2.2”项下方法制备胶塞供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果BHT、游离硫、抗氧剂1076的平均含量（n=6）分别为1.22、2.60、76.92µg·mL-1,RSD分别为1.7%、1.9%、1.6%，其他成分未检出，表明本方法重复性良好。

2.8加样回收率试验

取已知含量的胶塞样品（批号F181010901）适量，共9份，分别加入一定量的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表2。

表2加样回收率试验结果（n=9)

2.9样品含量测定

分别取剪碎后的各批胶塞适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，平行测定4次，记录峰面积并计算胶塞中抗氧剂的含量，见表3。

表3胶塞中各类抗氧剂的含量测定结果（n=30，µg·g-1)

2.10液相色谱质谱联用仪检测药品中BHT迁移量

2.10.1质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测方式：多反应监测（MRM）；负离子模式；质量数扫描范围m/z50～1500；进样量：1µL。多反应监测各离子对及各优化参数，BHT定量离子与定性离子质量数为219.0/203.0，去簇电压（DP）为-100V，碰撞能（CE）为-37.1eV。

2.10.2质谱测定胶塞及药品中BHT含量

分别取剪碎后的各批胶塞适量，按“2.2.2”项下方法制备胶塞供试品溶液；根据每日推荐最大剂量不超过4g的使用说明，取各批药品样品适量，每批各加入适量超纯水溶解（注射用头孢曲松钠溶解至0.25mg·mL-1，注射用头孢呋辛钠溶解至0.125mg·mL-1，注射用头孢噻吩钠溶解至0.125mg·mL-1），混合均匀，以1～2mL·min-1的流速缓慢过亲水亲脂的HLB固相萃取小柱，加水8mL超纯水冲洗小柱，抽干，用二氯甲烷-无水乙醇（2∶3)5mL洗脱小柱2次，收集第2次洗脱液，用二氯甲烷-无水乙醇（2∶3）定容至5mL。即得药品供试品溶液。将所有胶塞供试品溶液和药品供试品溶液均过0.22µm滤膜，再按“2.10.1”项下质谱条件进样测定，记录峰面积并计算其中抗氧剂的含量，结果见表4,BHT色谱图见图2，头孢类抗生素注射用粉针药品中BHT迁移色谱图见图3。

3、结果

应用以上所建立方法检测了10批卤化丁基胶塞供试品，结果显示，所有抽样药品的密封用丁基胶塞中均检出抗氧剂BHT、游离硫和抗氧剂1076，进一步应用HPLC-MS/MS方法检测，确认10批胶塞供试品均含有抗氧剂BHT，并且35批药品供试品中有一批被检出抗氧剂BHT（注射用头孢呋辛钠，批号9A0020A45，该批次注射用粉针所用溴化丁基胶塞批号为18036414），所溶出抗氧剂是否影响药品质量和用药安全，需要进一步深入研究[11,12,13]。

表4质谱测定胶塞及药品中抗氧剂BHT含量结果

图2BHT色谱图

图3头孢类抗生素注射用粉针药品中BHT迁移色谱图

4、讨论

4.1检测波长的选择

取BHT、抗氧剂3114、游离硫、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076对照品各适量，置于100mL量瓶中，加入5mL二氯甲烷溶解并用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，得单一对照品溶液，以无水乙醇为空白，于200～400nm波长范围内扫描，结果，BHT在204、277nm波长处，抗氧剂3114在205、228nm波长处，游离硫在203、217nm波长处，抗氧剂1010在207、217nm波长处，抗氧剂330在211nm波长处，抗氧剂1076在206、219nm波长处有较强吸收。参考文献并与厂家沟通后，推测药用卤化丁基胶塞中的抗氧剂和流离硫含量较低[14,15,16,17]，在220nm波长处灵敏度会相对较高，故选择220nm为检测波长。

4.2流动相的选择

本研究依据多篇文献研究比较其中所使用流动相体系时的分离度。结果以甲醇-水为流动相梯度洗脱时，各待测成分的分离度均较好、基线相对平稳无干扰，且保留时间适中，故选择甲醇-水（梯度洗脱）为流动相。

4.3固相萃取小柱的选择

由于抗氧剂不溶于水，采用亲水亲脂的HLB固相萃取小柱。选用美国月旭公司生产的WelchromBRP2g/12mL,20PK，效果较好。临用时用甲醇5mL活化小柱。

4.4样品处理方法的确定

综合考察：取药用卤化丁基胶塞样品剪碎，精密称取2g，置于具塞锥形瓶中，分别加入无水乙醇-正己烷-丙酮（4∶3∶3）、二氯甲烷-无水乙醇（2∶3）、无水乙醇20mL，密塞，称量，分别以超声（30min、1h）后浸泡24h和100℃加热回流（4、8、12h）处理，冷却后用相应溶剂补足减失的量，进样测定。结果发现，超声处理样品的峰面积较小，与回流处理的样品相比提取不充分；使用无水乙醇-正己烷-丙酮（4∶3∶3）进行萃取成分较多；加热回流至8、12h所提取成分再无变化，故选择加热回流时间为8h。

4.5小结

综上所述，本研究所建方法灵敏快速，操作简便，重复性好，可用于同时测定药用胶塞及头孢类抗生素注射用粉针样品中5种抗氧剂和游离硫的含量。

参考文献：

[1]刘成红,魏立平,罗小茹,等.注射用盐酸头孢替安与胶塞相容性研究[J].药物评价研究,2014,37(5):420.

[2]薛转茹.药用卤化丁基胶塞相容性研究[J].海峡药学,2017,29(7):288.

[3]郭志鑫,姜典财,孙会敏.药用卤化丁基胶塞质量状况分析[J].药物分析杂志,2011,31(2):399.

[4]国家食品药品监督管理局(CFDA).化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则(试行)[EB/OL].(2012-09-07).

[5]梁键谋,刘贵军,王建.注射用酒石酸吉他霉素胶囊中挥发性物质迁移的GC-MS/HPLC测定及与溶液澄清度相关性分析[J].药物分析杂志,2020,40(3):514.

[6]郭艳娟,李伟曹,杨倩,等.国产注射用头孢地嗪钠质量分析[J].中国抗生素杂志,2018,43(3):291.

[7]姜源,程福军.注射液用氯化丁基胶塞中的抗氧剂的测定和迁移测定[J].黑龙江医药,2016,29(3):436.

[8]李樾,梁婷婷,孙会敏.HPLC法测定注射用冷冻干燥用卤化丁基胶塞中抗氧剂1010及硫化剂在药液中的迁移[J].中国药事,2019,33(3):283.

[9]朱碧君,李婷婷,孙会敏,等.HPLC法同时测定药用卤化丁基胶塞中5种抗氧剂和游离硫的含量[J].中国药房,2018,29(18):2475.

[10]陈蓉,晏菊姣.药用丁基胶塞中抗氧剂BHT的UPLC法测定[J].中国药师,2018,21(8):1494.

[11]蒲小聪,陈蕊,游延军.HPLC法测定胶塞中抗氧剂1076向米卡芬净钠注射液中的迁移[J].药物分析杂志,2017,37(7):1298.

[12]冯靖,蔡心怡,刘言.药用丁基胶塞中抗氧剂--BHT和硫化剂--可提取硫的测定[J].药物分析杂志,2017,37(4):702.

[13]浦雨伟,崔萍,吴娟,等.药用定基胶塞中抗氧剂264､1010､5057迁移研究[J].药物分析杂志,2016,36(12):2231.

[14]周亚菊,蔡荣,张芳芳.注射用重组人生长激素中卤化丁基胶塞镁､钛元素的迁移研究[J].药物分析杂志,2016,36(5):929.

[15]赵霞,胡昌勤,金少鸿.药用丁基胶塞中易挥发性成分的成分分析[J].药物分析杂志,2006,26(3):315.

[16]李兴春,路杰,李洁,等.HPLC法测定高密度聚乙烯桶包装血液透析浓缩液中抗氧剂1010､抗氧剂330､抗氧剂1076､抗氧剂168的含量[J].药学研究,2016,35(2):86.

[17]朱碧君,胡红刚,李婷婷,等.HPLC法测定聚丙烯输液瓶中抗氧剂1010､抗氧剂1076､抗氧剂168､抗氧剂330的含量[J].药物分析杂志,2012,32(3):416.

王丽,赵锐,田恩圣,柴龙龙.35批次头孢类抗生素注射用粉针丁基胶塞中游离硫及常见抗氧剂的迁移研究[J].药物分析杂志,2020,40(11):2033-2041.