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不同周龄SD大鼠肝功能及肝脏病变的探讨

2022-02-10 319 上传者：管理员

摘要：目的本研究旨在探讨不同周龄SD大鼠,血肝功指标的差异以及肝脏非肿瘤性自发病变。方法分别收集6周龄、9周龄、12周龄、15周龄、18周龄和22周龄的空白对照组SD大鼠共480只,每组80只,雌雄各半。在对应周龄称重后取腹腔静脉全血进行各项肝功生化指标的检测,再取肝脏组织并计算脏器系数,做常规组织病理学检查。采用SPSS20.0软件进行方差分析、χ2检验和Fisher精确检验。结果SD大鼠的脏器系数随周龄增长而降低,雌、雄大鼠成年前（6～18周龄）各周龄组的脏器系数差异有统计学意义（F♀=135.33,F♂=51.96,P<0.05）;而成年后（18～22周龄）的脏器系数分布差异无统计学意义（P♀=0.28、P♂=0.86）。雌、雄大鼠肝功能指标TP和ALP在各周龄组的分布差异有统计学意义（P<0.001）。SD大鼠肝脏非肿瘤性自发病变散发且多见,其中肝脏炎细胞浸润和肝脏空泡样变在各周龄组的分布差异有统计学意义（P<0.001）。结论 SD大鼠的部分肝功能指标以及肝脏的部分非肿瘤性自发病变发生率存在周龄差异。

关键词：
SD大鼠
肝生化
肝脏病变
脏器系数
自发病变
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我国目前各类健康相关产品的安全性毒理学评价中，SD大鼠是常用的大鼠品系，它具有遗传学背景一致，生长迅速，个体差异小、实验数据较准确等优点[1,2,3]。肝脏是以代谢为主的重要器官，也是疾病和药物最常损害的靶器官[4]，其相对重量、各项功能指标以及组织病理学改变均可反映外来化学物的毒性情况[5]，而区别肝脏的病变是由受试物引起还是自发性病变尤其重要。因此本研究取亚慢性毒性试验和亚急性毒性试验的空白对照组SD大鼠在不同发育阶段的血样和病理脏器，主要探究SD大鼠肝脏的非肿瘤性自发病变和血生化指标随年龄增长有无差异并分析其变化规律。

1、材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

由四川省中医药科学院实验动物中心提供，实验动物使用许可证号：SCXK（川）2018-19,SPF级离乳SD大鼠雌雄各半，共480只。动物饲养于四川省疾病预防控制中心屏障级动物房，饲料生产许可证号：苏饲证（2019)03058。本课题所有动物实验均得到四川省疾病预防控制中心实验动物管理小组正式批准（SC/DL-GZ023）。

1.1.2 仪器与试剂

奥林巴斯全自动生化分析仪（日本AU-400),HP300型全自动封闭组织脱水机（达科为生物技术股份有限公司），1516型石蜡切片机（德国Leica仪器有限公司），TB-718D2型生物组织自动包埋机（湖北泰维医疗科技有限公司），BX43型显微镜（日本Olympus公司），电子天平（上海天美天平仪器有限公司）。

甲醛溶液（成都金山化学试剂公司），无水乙醇（成都科隆化学），中性塑胶（无锡市江源实业公司），HE染色液和透明剂（珠海贝索生物技术有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组

动物来自于亚慢性毒性试验和亚急性毒性试验的空白对照组，按时间分为6周龄组、9周龄组、12周龄组、15周龄组、18周龄组和22周龄组，每组80只大鼠且雌雄各半。根据SD大鼠生长发育年龄可分别将6～9周龄、12～15周龄和18～22周龄划分为人类的儿童期、青年期和成年期[6,7]。实验期间生长发育正常，每周称取并记录一次大鼠的体质量与摄食量。

1.2.1 脏器系数测定

取大鼠肝脏，去除周围组织后称总质量，计算脏器系数。

1.2.2 血生化测定

禁食16h后麻醉处死，腹腔静脉取血，血样静置后离心，取上清采用全自动血生化分析仪检测血液中的各项肝功指标：血清总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、总胆红素（TBIL)、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）和碱性磷酸酶（ALP）。

1.2.3 病理学检查

常规石蜡切片HE染色，在光学显微镜下阅片。记录肝脏所有的非肿瘤性病变并选取有代表性的视野进行拍照。

1.2.4 统计分析

采用SPSS20.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布或近正态分布的以描述，脏器系数和血生化指标采用单因素方差分析。计数资料率采用趋势性χ2验检或Fisher精确检验，检验水准α=0.05，两两比较时用校正后水准α'=α/3=0.0167。

2、结果

2.1 不同周龄SD大鼠的体重和肝脏的脏器系数

雌、雄大鼠成年前（6～18周龄）各周龄组间的脏器系数分布差异有统计学意义（F♀=135.33,F♂=51.96,P<0.05),18周龄与22周龄的脏器系数分布差异无统计学意义（P♀=0.28、P♂=0.86,P>0.05）。且雄鼠脏器系数略低于雌鼠。雌、雄SD大鼠的体重和肝重与周龄呈正相关，脏器系数与周龄呈负相关（表1）。

2.2 不同周龄SD大鼠血肝功测定

结果表明不同周龄的肝功能指标波动较大，但部分指标具有一定的时间相关性，雌、雄SD大鼠ALP在6周龄时最高，随着周龄增长不断降低且各周龄间差异有统计学意义（F♀♂=508.88、108.36,P<0.001），雄鼠ALP略高于雌鼠，雌、雄大鼠TP在6周龄时最低，TP随着周龄增长不断升高且各周龄间差异有统计学意义（F♀♂=55.96、149.90,P<0.001);AST随着周龄增长先降后升，ALT各周龄间无明显变化趋势（表2）。

2.3 不同周龄SD大鼠肝脏非肿瘤自发性病理改变

随着周龄的增加，肝脏炎细胞浸润和肝脏空泡样变发病率增加（χ2趋势=12.05、34.9,P<0.001），其中成年组（18～22周龄）大鼠的肝脏空泡样变发病率高于儿童组（6～9周龄）和青年组（12～15周龄），差异有统计学意义（χ2=26.46、21.19,P<0.001）（表3）。

各组雌、雄大鼠肝脏的非肿瘤性病变以肝脏炎细胞浸润、肝脏空泡样变、肝内胆管增生、肝纤维化、肝细胞间质充血为主（图1）。

3、讨论

在安全性毒理学评价实验中，大鼠的脏器系数、血生化指标和组织病理学检查不仅受遗传物质控制，还因年龄、性别、环境等不同而变化[8,9]。其中脏器重量及脏器系数可以宏观的反应脏器的改变；血生化检测是评价过程中比较客观、敏感的指标[10]；而组织病理学诊断则能比较准确地回答受试物引起的毒性损伤的部位、程度、性质以及预后等问题[11,12]。

SD大鼠的体重和肝重均随动物周龄的延长而增加，雌雄大鼠体重和肝脏湿重分别在儿童期（6～9周龄）与青年期（12～15周龄）均处于快速增长阶段，而成年期（18～22周龄）增长逐渐趋于平缓，肝脏重量变化范围逐渐缩小，而同期的动物体重增长幅度高于肝脏，从而导致肝体系数逐渐降低。同性别不同周龄的肝体系数有显著性差异，与柳云恩[13]等报道结果一致。

临床上常用TP、ALB、TBIL、AST、ALT和ALP等指标来评价肝脏功能。血清中ALP主要来自肝脏和骨骼，随着年龄的增长ALP活性不断降低，变化趋势与人类相似。TP在6周龄时最低而后随着年龄增长不断上升，可能与儿童期与青年期大鼠机体代谢和营养需求都比较旺盛相关[15]。AST随着周龄增长先降后升，在成年期之前接近最低值，ALT各周龄间则无明显变化趋势。因此认为周龄差异对血肝功指标有较明显影响，实际应用中应当考虑此因素。

自发病变一般分为肿瘤性和非肿瘤性[16]，而本文主要探讨非肿瘤性自发病变，由于对照组大鼠是未经染毒和任何人为干预，其发生的非肿瘤病变我们认为是自发性非肿瘤病变[17,18]。本研究结果显示，SD大鼠肝脏非肿瘤性自发病变雌雄之间无差异，随着周龄增长，炎细胞浸润和空泡样病变增加，与高洪彬[19]等报道基本一致。空泡样变形成的主要机制有：肝细胞内离子稳态被破坏导致细胞内液增多形成肝细胞水肿；体内游离脂肪酸过多或脂肪代谢异常形成肝脂肪变[20,21]。而炎细胞浸润的增加可能与饲养环境中有机会接触化学消毒剂或病原微生物引起的慢性感染相关[22]。

本研究主要针对不同周龄SD大鼠，对连续不同生长阶段（儿童期、青年期、成年期）的大鼠进行观察，收集其肝脏的血生化指标和组织病理改变的数据，结果显示自发性非肿瘤病变多集中于成年期大鼠，而脏器系数与血肝功指标各周龄间的波动则更集中于儿童期和青年期的大鼠。提示在安全性毒理学评价实验中，肝生化和病理的诊断要根据不同年龄来制定正常参考值范围。同时也为日常工作积累了宝贵的背景数据资料，为四川省疾病预防控制中心对检测结果进行质量控制以及参加实验室间比对打下基础。

参考文献:

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