光动力治疗(Photodynamic therapy, PDT)在1978年首次成功应用于临床，引起人们广泛关注。传统的光动力治疗包括3大要素，即光敏剂、光源和氧气，光敏剂在光源的照射下激发并敏化氧分子，产生单线态氧，从而对肿瘤造成杀伤作用。光动力治疗除了可以直接杀死肿瘤细胞、破坏肿瘤血管，还具有免疫调节作用，可以作为辅助疗法联合化疗、放疗和免疫治疗等，增强肿瘤杀伤作用，也可以单独用于多种肿瘤的治疗[1,2,3]。与手术切除、放疗、化疗、分子靶向治疗和免疫治疗等肿瘤治疗方法相比，光动力治疗具有非侵入、光源靶向和低毒等特点[4,5]。光敏剂对于光动力治疗至关重要，吲哚菁绿是一种被美国FDA批准的影像剂，也被用于慢性牙周炎光动力治疗的临床研究[6]。但是吲哚菁绿的稳定性差，在水溶液中容易分解[7,8]。新吲哚菁绿(New indocyanine green, IR820)是在吲哚菁绿结构基础上改造而来，具有更好的稳定性，且比吲哚菁绿具有更高的单线态氧量子产率，在光动力治疗中具有较好的应用前景[9,10]。但是IR820应用于光动力治疗仍有一些问题，例如在生理环境下容易聚集、肿瘤细胞摄取效率低和血浆半衰期短等[11,12,13]。

通过纳米药物递送系统负载光敏剂以改善光敏剂的稳定性和体内行为是目前研究的热点。目前文献中已报道有多种载IR820纳米制剂，但是仍存在肿瘤细胞摄取效率低、释放不可控或具有潜在的生物相容性问题等缺陷[14,15]。为此，研究将临床中已广泛应用的甲氧基聚乙二醇和内源性小分子胆固醇通过二硫键偶联，合成具有还原响应性的甲氧基聚乙二醇-胆固醇偶联物，然后通过溶剂扩散法制备了载IR820胶束，用于增强IR820的光动力治疗作用。研究测定了所制备载IR820胶束的载药量、包封率、粒径和电位，研究了载IR820胶束的稳定性、体外药物释放行为、体外光动力效应、肿瘤细胞摄取行为和体外对肿瘤细胞的光动力杀伤作用。

1、实验部分

1.1 材料和仪器

胆固醇(CH)、3,3’-二硫代二丙酸(DTDPA)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDCI)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)、还原型谷胱甘肽(GSH)、1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)、新吲哚菁绿(IR820)和2,7-二氯二氢荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)、高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、青霉素和链霉素购自Gibco公司；甲氧基聚乙二醇(mPEG-OH相对分子质量2 000和5 000)购自深圳市魅罗科技有限公司；小鼠成纤维细胞NIH3T3和人类肝癌细胞HepG2购自中国科学院细胞库。

采用Bruker公司AVANCE Ⅱ 500 MHz核磁共振波谱仪记录核磁共振氢谱(1H NMR);采用Thermo公司iS50傅里叶变换红外光谱仪记录红外光谱(FT-IR);采用武汉市华天电力自动化有限责任公司的HTYZL-H全自动张力测定仪测定表面张力；采用Tecan公司Spark多功能酶标仪测量吸光度和荧光强度；采用尼康公司TI-S倒置生物显微镜进行荧光成像；采用英国马尔文仪器有限公司ZSE激光粒度仪测量粒径和电位。

1.2 化学合成与表征

将3,3’-二硫代二丙酸(2 mmol, 420 mg)、胆固醇(1 mmol, 387 mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(4 mmol, 767 mg)和4-二甲氨基吡啶(1 mmol, 122 mg)溶于20 mL二氯甲烷，加热回流过夜，旋干后加入少量乙酸乙酯溶解，加入至过量乙醇中沉淀、搅拌，然后过滤，乙醇洗涤，真空干燥得3,3’-二硫代二丙酸单胆固醇酯(CH-DTDPA)(高效液相色谱测得纯度为97%)。

将3,3’-二硫代二丙酸单胆固醇酯(0.2 mmol, 116 mg)、甲氧基聚乙二醇(相对分子质量5 000, 0.2 mmol, 1 000 mg或相对分子质量2 000,0.2 mmol, 400 mg)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.8 mmol, 153 mg)和4-二甲氨基吡啶(0.2 mmol, 24 mg)溶于20 mL二氯甲烷中，加热回流24 h, 然后旋干，加入超纯水分散，于超纯水中透析3 d, 8 000 r/min离心10 min, 取上清液冷冻干燥得二硫键连接的甲氧基聚乙二醇-胆固醇偶联物(mPEG-SS-CH)(高效液相色谱测得纯度为92%～95%)。

分别称取10 mg CH-DTDPA,mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH溶于氘代氯仿，测量核磁共振氢谱。分别称取5 mg mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH与溴化钾共同研磨、压片，测定红外光谱。配置mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH水溶液，通过测定表面张力的方法测量临界胶束质量浓度。

1.3 载药纳米粒的制备和性能测定

称取20 mg IR820和200 mg mPEG5000-SS-CH或mPEG2000-SS-CH,加入至2 mL二甲基亚砜中，室温避光搅拌过夜，然后逐滴加入至20 mL超纯水中，边滴加边超声，滴加完毕后继续超声5 min, 然后于超纯水中避光透析3 d, 8 000 r/min离心10 min, 取上清液避光冷冻干燥得IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH。称取IR820@mPEG5000-SS-CH或IR820@mPEG2000-SS-CH冻干粉，溶于1 mL二甲基亚砜，测量760 nm处吸光度，通过标准曲线法测得IR820的质量浓度，IR820的载药量为载药纳米粒上负载的IR820的质量分数，IR820的包封率为IR820投料量中负载的IR820的质量分数。配置IR820质量浓度为20 μg/mL的游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH水溶液，测量紫外-可见吸收光谱。配置IR820质量浓度为100 μg/mL的游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4),室温避光孵育，每天测量IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的粒径和电位，测量6 d, 每天拍照记录各样品外观，记录5 d。

1.4 体外药物释放

配置IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH磷酸盐缓冲液(10 mmol/L,pH为7.4),加入至透析袋中，放入磷酸盐缓冲液(10 mmol/L,pH为7.4)或含有10 mmol/L GSH的磷酸盐缓冲液(10 mmol/L,pH为7.4)中，37 ℃下在摇床中避光震荡(150 r/min),在2,4,6,16,24,40,48 h分别取出1 mL的释放液，再补充1 mL的空白释放液，测量760 nm处吸光度，通过标准曲线法测得IR820的质量浓度，计算IR820的累积释放量。

1.5 体外光动力效应

配置DPBF质量浓度为40 μg/mL 、IR820质量浓度为20 μg/mL的游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的水溶液，分别用激光功率为0.25 W/cm2、波长为808 nm的激光照射1,2,3,4,5 min, 测量405 nm处吸光度，以不加激光照射的相应溶液作为对照对各组吸光度进行归一化。配置DPBF质量浓度为40 μg/mL,IR820质量浓度为5,10,20 μg/mL的游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH水溶液，分别用功率为0.25 W/cm2、波长为808 nm的激光照射3 min, 测量405 nm处吸光度，以不加激光照射的相应溶液作为对照对各组吸光度进行归一化。

1.6 细胞摄取

小鼠成纤维细胞NIH3T3和人类肝癌细胞HepG2使用含有10%胎牛血清和1%青霉素及链霉素的高糖DMEM培养基，于细胞培养箱中培养(37 ℃,5%二氧化碳)。将HepG2细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，贴壁培养过夜，然后将培养基换成含游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的无血清培养基(IR820质量浓度为20 μg/mL),于细胞培养箱中37 ℃条件下培养6 h, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH 7.4)洗涤细胞3次，用4%多聚甲醛固定细胞，通过荧光显微镜观察各组细胞中新吲哚菁绿的荧光。

将HepG2细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成含游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的无血清培养基(IR820质量浓度为20 μg/mL),于细胞培养箱中37 ℃条件下培养4 h和6 h, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)洗涤细胞3次，加入胰酶消化细胞，然后离心分离细胞，加入1% 曲拉通X-100溶液裂解细胞过夜，然后离心10 min(10 000 r/min),取上清测量760 nm处吸光度，通过标准曲线法测得裂解液中新吲哚菁绿的质量浓度，计算细胞摄取量。

1.7 细胞毒性和光动力杀伤作用

在HepG2细胞上评价游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的光动力杀伤作用。将HepG2细胞以每孔5 000个细胞的密度接种于96孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成含有游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的无血清培养基，于细胞培养箱中37 ℃条件下培养4 h, 然后用功率为0.25 W/cm2 或0.50 W/cm2、波长为808 nm的激光照射3 min, 再于细胞培养箱中37 ℃条件下培养20 h, 加入20 μL 噻唑蓝溶液(5 mg/mL),于细胞培养箱中37 ℃条件下培养4 h, 吸去培养基，加入150 μL二甲基亚砜，溶解产生的紫色结晶，然后通过酶标仪测量吸光度，以空白培养基培养的细胞为100%生存率，计算各组细胞相对存活率。通过细胞活力检测(MTT)法研究了空载体对NIH3T3细胞的毒性。

1.8 细胞活性氧水平

在HepG2细胞上通过活性氧绿色荧光探针DCFH-DA评价游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH处理的细胞在808 nm激光照射下引起的细胞活性氧水平升高情况。DCFH-DA本身无荧光，进入细胞后被酯酶水解生成2’,7’-二氯二氢荧光素，后者可以被活性氧快速氧化生成强荧光产物2’,7’-二氯荧光素，从而实现细胞内活性氧的荧光检测。将HepG2肝癌细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成含有游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的无血清培养基(IR820质量浓度为20 μg/mL),于细胞培养箱中37 ℃条件下培养4 h, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)洗涤细胞3次，加入含5 μg/mL DCFH-DA的培养基，孵育20 min, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)洗涤细胞3次，用0.25 W/cm2,808 nm激光照射3 min, 照射完毕后，通过荧光显微镜观察各组细胞中的绿色荧光。

将HepG2肝癌细胞以每孔10万个细胞的密度接种于12孔板，培养过夜贴壁，然后将培养基换成含有游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的无血清培养基(IR820质量浓度为20 μg/mL),于细胞培养箱中37 ℃条件下培养4 h, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)洗涤细胞3次，加入含5 μg/mL DCFH-DA培养基，孵育20 min, 然后吸去培养基，用磷酸盐缓冲液(6.7 mmol/L,pH为7.4)洗涤细胞3次，用0.25 W/cm2,808 nm激光照射3 min, 照射完毕后，加入0.5 mL 1% 曲拉通X-100溶液裂解细胞过夜，然后离心10 min(10 000 r/min),取上清液测量525 nm处荧光，激发波长为485 nm, 以空白培养基培养的细胞作为对照对各组细胞活性氧水平进行归一化。

2、结果与讨论

2.1 合成与表征

mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的合成路线如图1(a)所示，胆固醇首先与3,3’-二硫代二丙酸缩合得到3,3’-二硫代二丙酸单胆固醇酯(CH-DTDPA),然后再分别与相对分子质量为5 000 和2 000的甲氧基聚乙二醇缩合即可得到mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH。除了胆固醇的特征峰外，CH-DTDPA的核磁共振氢谱在2.93和2.70处出现了3,3’-二硫代二丙酸中的亚甲基峰(图1(b)),表明CH-DTDPA的成功合成。与CH-DTDPA的核磁共振氢谱相比，mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的核磁共振氢谱中出现了PEG的峰，表明mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的成功合成。mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的红外光谱中均出现了酯键中的

伸缩振动峰(1 730 cm-1)(图1(c)),表明胆固醇和甲氧基聚乙二醇与3,3’-二硫代二丙酸通过酯键偶联，以上结果显示mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH被成功合成。

图1 mPEG-SS-CH的合成与表征  

通过表面张力法测定了mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的临界胶束质量浓度。如图2所示，mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH水溶液的表面张力均随着质量浓度的增加而降低，通过线性拟合的相交点得到mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的临界胶束质量浓度分别为4.23 μg/mL和4.45 μg/mL,如此低的临界胶束质量浓度有利于mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH在血液稀释的条件下仍然保持稳定的胶束结构。

图2 表面张力法测定临界胶束质量浓度  

2.2 载药纳米粒制备、表征与稳定性

通过溶剂扩散法将IR820负载于mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH胶束中，制备得到IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH,见表1。IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的水合直径(Dh)分别为(229.0 ± 7.3) nm和(192.5 ± 1.8) nm, 多分散性指数(λPDI)均小于0.3,表明具有较窄的粒径分布，Zeta电位分别为-(15.8 ± 1.1) mV和-(12.7 ± 0.5) mV。由于大部分的血浆蛋白带有负电荷，因此IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的Zeta负电位有利于其通过静电排斥作用抑制蛋白吸附，逃避网状内皮系统的清除，从而有利于延长血液驻留时间。IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的载药量分别为4.2%和7.1%,包封率分别为46.2%和78.0%,IR820@mPEG2000-SS-CH的载药量和包封率高于IR820@mPEG5000-SS-CH,主要是由于mPEG2000-SS-CH中疏水段的比例高于IR820@mPEG5000-SS-CH,有利于与IR820发生疏水相互作用。

表1 IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的水合粒径和电位

图3 IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的表征和稳定性  

2.3 体外药物释放

通过透析法在体外研究了IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的药物释放行为。如图4所示，IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在磷酸盐缓冲液和含有10 μmol/L GSH的磷酸盐缓冲液中释放缓慢，而在含有10 mmol/L GSH的磷酸盐缓冲液中可以快速释放。在磷酸盐缓冲液中，IR820@mPEG5000-SS-CH在6,24,48 h分别释放了(20.8±1.2)%,(30.5±2.9)%和(32.9±2.7)%的IR820;在含有10 μmol/L GSH的磷酸盐缓冲液中，IR820@mPEG5000-SS-CH在6,24,48 h分别释放了(23.5±3.2)%,(33.4±1.3)%和(38.8±1.9)%的IR820;在含有10 mmol/L GSH的磷酸盐缓冲液中，IR820@mPEG5000-SS-CH在6,24,48 h分别释放了(46.1±3.9)%,(61.1±5.5)%和(73.4±4.3)%的IR820,IR820@mPEG2000-SS-CH的释放略慢于IR820@mPEG5000-SS-CH,释放趋势与IR820@mPEG5000-SS-CH类似。以上结果显示IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH具有还原响应性释放IR820的功能，有利于IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在血液循环中保持稳定，在肿瘤细胞内高浓度GSH微环境下选择性释放IR820。

图4 体外药物释放曲线   

2.4 体外光动力效应

通过单线态氧探针DPBF研究了IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在0.25 W/cm2,808 nm激光照射下产生单线态氧量的情况，DPBF可以和单线态氧反应分解，导致吸光度降低，DPBF在405 nm处吸光度降低越多，表明产生的单线态氧量越多。如图5所示，游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在0.25 W/cm2,808 nm激光照射下产生单线态氧量均具有时间依赖性和质量浓度依赖性，IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH产生单线态氧效率略高于游离IR820,可能是由于IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的最大吸收波长与808 nm激光更匹配所导致。

图5 激光照射下产生单线态氧量的情况

2.5 细胞摄取

通过荧光显微镜研究了IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的肿瘤细胞摄取(图6)。由图6(a)可知，与HepG2细胞孵育6 h, IR820@mPEG2000-SS-CH处理的细胞比IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820处理的细胞具有更强的红色荧光，表明IR820@mPEG2000-SS-CH的细胞摄取量高于IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820。细胞摄取定量结果显示，与HepG2细胞孵育4,6 h, IR820@mPEG2000-SS-CH的细胞摄取量均显著高于游离IR820(p<0.05,p<0.01),在6 h, IR820@mPEG2000-SS-CH的细胞摄取量还显著高于IR820@mPEG5000-SS-CH(图6(b),p<0.05)。以上结果显示，IR820@mPEG2000-SS-CH可以显著提高IR820的肿瘤细胞摄取。

图6 HepG2细胞摄取   

2.6 细胞毒性和光动力杀伤作用

如图7所示，在NIH3T3细胞上研究了mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH的生物相容性。如图7(a)所示，mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH质量浓度增加到800 μg/mL,细胞存活率仍高于90%,表明mPEG5000-SS-CH和mPEG2000-SS-CH具有良好的生物相容性。在不加激光照射条件下，游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH处理的HepG2细胞存活率均高于80%(图7(b)),表明游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在不加激光照射条件下细胞毒性微弱。在0.25 W/cm2, 808 nm和0.50 W/cm2,808 nm激光照射条件下，游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH对HepG2细胞的光动力杀伤作用均具有浓度依赖性，且在0.50 W/cm2 照射功率条件下光动力杀伤作用高于0.25 W/cm2照射功率条件(图7(c)和图7(d)),根据图7(c)和图7(d)计算出相应的半抑制浓度(IC50),见表2,IR820@mPEG2000-SS-CH的半抑制浓度低于IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820,表明IR820@mPEG2000-SS-CH比IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820具有更强的光动力杀伤作用，主要由于IR820@mPEG2000-SS-CH的细胞摄取量高于IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820(图6)。

图7 细胞毒性和光动力杀伤作用   

表2 载药纳米粒在808 nm激光照射条件下对HepG2细胞的半抑制浓度

2.7 细胞活性氧水平

通过活性氧(ROS)绿色荧光探针DCFH-DA检测在0.25 W/cm2,808 nm激光照射条件下，游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH处理的HepG2细胞活性氧水平。由图8(a)可知，IR820@mPEG2000-SS-CH处理的细胞荧光强度高于IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820处理的细胞，定量结果也显示IR820@mPEG2000-SS-CH处理的细胞活性氧水平显著高于IR820@mPEG5000-SS-CH(**p<0.01)和游离IR820(**p<0.01)处理的细胞(图8(b))。这一结果与HepG2细胞的光动力杀伤作用结果相一致，表明游离IR820,IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH在808 nm激光照射下通过提高肿瘤细胞活性氧水平发挥杀伤肿瘤细胞作用。

图8 细胞活性氧检测   

3、结论

综上所述，研究制备了两种还原响应性聚合物胶束，用于负载IR820,增强IR820的光动力治疗作用。制备的IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH可以显著提高IR820在生理环境下的稳定性，具有还原响应性药物释放特性，其中IR820@mPEG2000-SS-CH比IR820@mPEG5000-SS-CH和游离IR820具有更高的细胞摄取量和肿瘤细胞光动力杀伤作用，且载体生物相容性良好。IR820@mPEG5000-SS-CH和IR820@mPEG2000-SS-CH的体内光动力治疗作用有待进一步探索。

参考文献:

[15]顾怡雯,左甜甜,张君,等.共载多西他赛和IR820的化疗/光热/光动纳米粒的抗肿瘤增殖及转移作用考察[J].中国医药工业杂志,2020,51(4):490-498.

基金资助:江苏省高等学校自然科学研究面上资助项目(20KJB350005); 常州市重点研发计划资助项目(CJ20210030);

文章来源:胡航,肖文,陶亚宇,等.负载新吲哚菁绿的还原响应性聚合物胶束增强肿瘤光动力治疗[J].常州大学学报(自然科学版),2024,36(04):82-92.