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瑞帕利辛改善棕榈酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗

2024-07-18 81 上传者：管理员

摘要：目的：探讨瑞帕利辛（Reparixin）对棕榈酸（PA）诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的影响。方法：CCK-8(cell counting Kit-8)法检测不同浓度的PA或Reparixin处理后C2C12成肌细胞活力；将C2C12成肌细胞分为牛血清白蛋白组（BSA组）、PA组、PA+Reparixin组，免疫印迹检测SOCS3蛋白水平及胰岛素信号分子蛋白激酶B(Akt)和160 kD的蛋白激酶B底物（AS160）磷酸化水平，q PCR检测SOCS3 mRNA水平。将C2C12-GLUT4myc小鼠成肌细胞同上分组，ELISA检测细胞GLUT4myc转位。结果：0、100、200、300μmol/L的PA和0、20、30、40μmol/L的Reparixin均不影响C2C12细胞活力。PA降低胰岛素磷酸化Akt和AS160的作用（均P<0.000 1）,Reparixin逆转PA的影响（F=86.78、264.6,P<0.001,P<0.000 1）。PA降低胰岛素促进GLUT4myc转位的作用（P<0.001）,Reparixin逆转PA的影响（F=41.4,P<0.01）。PA上调SOCS3 mRNA(P<0.001)和蛋白水平（P<0.05）,Reparixin逆转PA对SOCS3的影响（F=51.64、7.97,P<0.001,P<0.05）。结论：Reparixin可能通过下调SOCS3基因和蛋白表达，缓解棕榈酸诱导的小鼠C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。

关键词：
成肌细胞
瑞帕利辛
糖尿病
细胞因子信号转导抑制因子3
胰岛素抵抗
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2型糖尿病是以高血糖为主要特点的代谢性病变，其重要特征是胰岛素抵抗[1]，表现为胰岛素在其靶组织的作用减弱。骨骼肌是胰岛素最大的靶组织，餐后升高的葡萄糖80%左右由胰岛素刺激骨骼肌摄取[2]。胰岛素与骨骼肌细胞膜上的胰岛素受体结合，磷酸化胰岛素受体底物（IRS）、磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）、蛋白激酶B(Akt）和160 kD的蛋白激酶B底物（AS160），进而促进葡萄糖转运蛋白4(GLUT4）从胞质转位到细胞膜上，转运葡萄糖进入细胞，达到降低血糖的作用[3]。

细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3）是细胞因子信号转导抑制蛋白家族成员，负责调节细胞因子信号转导，SOCS3干扰胰岛素信号分子的正常功能，使胰岛素信号转导减弱，导致胰岛素抵抗[4]。研究报道，肝脏中过度表达SOCS3导致胰岛素抵抗，抑制糖尿病小鼠SOCS3的表达可改善胰岛素抵抗[5]。

Reparixin是白细胞介素8受体（CXCR1/2）的抑制剂[6]。本研究旨在探讨Reparixin对棕榈酸诱导的C2C12小鼠成肌细胞胰岛素抵抗状态的影响及其潜在的分子机制。通过分析Reparixin如何影响胰岛素信号通路，尤其是在调节SOCS3表达方面，为开发新的糖尿病治疗策略提供科学依据。本研究不仅有助于深化对胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制的理解，而且为探索新的治疗靶点提供了重要信息。

1、材料与方法

1.1 实验材料

小鼠C2C12成肌细胞株（美国ATCC公司），过表达GLUT4myc的C2C12小鼠成肌细胞株（C2C12-GLUT4myc，与加拿大Amira Klip教授实验室合作建立），当GLUT4myc从胞质转位到细胞膜上转运葡萄糖进入细胞时，其myc表位暴露在胞外，可以用ELISA法简便的检测GLUT4myc转位（相当于检测葡萄糖摄取），避免了使用放射性同位素方法检测葡萄糖摄取。牛血清白蛋白（中国鼎国生物技术公司），DMEM和opti-MEM培养基（美国Gibco公司），胎牛血清（以色列Bioind公司），瑞帕利辛（美国MCE公司），棕榈酸（美国Sigma公司），CCK-8试剂盒（爱必信），抗myc单克隆抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司），Trizol（美国Ambion公司）、逆转录试剂盒和qPCR Mix（北京TransGen Biotech公司），磷酸化Akt抗体、磷酸化AS160抗体和SOCS3抗体（美国CST公司），β-actin抗体（中国Abclonal公司），耦联HRP的山羊抗鼠抗体和耦联HRP的山羊抗兔抗体（美国JacksonImmuno Research公司），多聚甲醛（Biosharp生物科技公司），增强化学发光底物检测试剂盒（美国Millipore公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养

分别将冻存的C2C12成肌细胞和C2C12-GLUT4myc细胞由液氮中取出，于37℃水浴中迅速融化，用含10%FBS的DMEM在37℃、5%CO2培养箱中培养，显微镜下观察细胞形态和生长密度，当细胞密度达到80%～90%时，即可传代接板。

1.2.2 CCK-8实验

将C2C12成肌细胞以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，细胞培养箱孵育24 h，然后分别加入0、100、200、300μmol/L PA或0、20、30、40μmol/L Reparixin孵育24 h，检测对C2C12成肌细胞活力影响，每孔避光加入10μL CCK-8试剂，细胞培养箱中孵育1 h,450 nm波长酶标仪检测吸光度。

1.2.3 免疫印迹

C2C12成肌细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组，分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h，加或不加100 nmol/L胰岛素刺激10 min。提取各组细胞的总蛋白，并通过BCA蛋白测定法确定蛋白浓度。配制含有等量蛋白的样品，加入缓冲液（含有SDS），煮沸10 min使蛋白质变性。准备10%SDS-PAGE凝胶，并将样品及蛋白marker加到凝胶孔中。首先以80 V电压电泳至样品和marker开始分离形成清晰线条，调整电压至120 V，继续电泳直到样品至凝胶最底端。电泳后，使用湿转法将蛋白从凝胶转移到PVDF膜上。在110 V电压下进行转移2 h。电转后，用3%的BSA溶液在室温下封闭PVDF膜2 h。封闭结束后将PVDF膜按照蛋白分子量大小将目的条带切下，用含有一抗的孵育液（SOCS3的稀释比例为1 500,Akt、AS160为1 1 000,β-actin为1 5 000）覆盖膜，于4。C摇床上过夜孵育。随后，使用TBST清洗膜4次，每次10 min。加入对应的二抗溶液（1 5 000）室温摇床孵育2 h。再次用TBST清洗膜4次，每次10 min。使用显影仪，预冷30 min后，将显影液滴在PVDF膜上曝光，Image J软件分析条带。

1.2.4 ELISA

当GLUT4myc转运至细胞膜上后，其myc表位暴露于细胞外，可以用ELISA方便的检测，避免使用同位素等复杂方法。将C2C12-GLUT4myc细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组，分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h，加或不加胰岛素刺激30 min（背景孔不做任何处理），检测不同组细胞GLUT4myc转位情况。加预冷的PBS+(500 m LPBS+1 m L 1 mol/L MgCl2+1 m L 1 mol/L CaCl2）洗两次，加入4%PFA（多聚甲醛）置于冰上10min，室温10min,PBS+洗两次，加入0.1 mol/L甘氨酸室温10 min,PBS+洗两次，加入5%山羊血清（GS）室温10 min后弃去，加入抗myc抗体，室温摇床1h,PBS+洗3次，每次5 min，加入耦联HRP的羊抗鼠二抗室温摇床1 h,PBS+洗3次，每次5 min，吸净PBS+，加入邻苯二胺（OPD）避光反应2 min，用3 mol/L HCl终止反应，避光静置2 min，吸取200μL上清，加到96孔板中，492 nm波长酶标仪测吸光度。所得OD值减去背景孔（仅用耦联HRP羊抗鼠二抗孵育）的OD值，计算其余各组OD值相对于对照组（设为1）的倍数，即为细胞膜GLUT4myc水平相对于对照组的倍数。

1.2.5 RNA提取和qRCR

将C2C12成肌细胞分为BSA组、PA组和PA+Reparixin组，分别用BSA、300μmol/L PA、300μmol/L PA+40μmol/L Reparixin孵育24 h，然后收集各组细胞检测不同分组RNA表达情况。各孔加入500μL Trizol裂解细胞，异丙醇沉淀法提取RNA。分光光度计检测RNA浓度，根据逆转录试剂盒操作步骤逆转录合成cDNA，将cD-NA、上下游引物、2×TransStart Tip Green Qpcr SuperMix混合成20μL的体系，使用LightCycler96运行程序。根据q PCR得出的荧光曲线的Ct值，以β-actin基因为内参，用2-ΔΔCt计算结果。所用引物序列见表1。

表1 扩增反应所需引物序列

1.3 统计学处理

使用GraphPad Prism8软件进行统计学分析，实验数据均重复3次及以上。符合正态分布的计量资料均以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA),P<0.05为差异有统计学意义。

2、结果

2.1 PA和Reparixin对C2C12成肌细胞活力的影响

PA孵育后C2C12成肌细胞的活力结果如图1A。0、100、200、300μmol/L的PA均不影响C2C12成肌细胞活力（F=2.717,P>0.05），选用300μmol/L PA作为后续实验浓度。Reparixin孵育后C2C12成肌细胞的活力结果如图1B。0、20、30、40μmol/L均不影响C2C12成肌细胞活力（F=2.018,P>0.05），选用40μmol/L作为后续实验浓度。

图1 PA和Reparixin对C2C12成肌细胞活力的影响

2.2 Reparixin对C2C12成肌细胞Akt和AS160磷酸化的影响

结果如图2所示，PA降低胰岛素磷酸化Akt和AS160的作用（均P<0.000 1),Reparixin逆转PA的影响（F=86.78、264.6，均P<0.0001）。

2.3 Reparixin对C2C12-GLUT4myc细胞GLUT4myc转位的影响结果

如图3所示，与BSA组相比，PA组胰岛素促进GLUT4myc转位的作用降低（P<0.0001），与PA组相比，PA+Reparixin组胰岛素促进GLUT4myc转位的作用显著升高（F=41.4,P<0.01）。2.4 Reparixin对C2C12成肌细胞SOCS3表达的影响结果如图4，与BSA组相比，PA组SOCS3 m R-NA和蛋白水平均显著升高（P<0.001,P<0.05）。与PA组相比，PA+Reparixin组SOCS3 m RNA和蛋白水平均显著降低（F=51.64、7.97,P<0.001,P<0.05）。

图2 免疫印迹检测C2C12成肌细胞Akt和AS160的磷酸化

图3 ELISA检测C2C12-GLUT4myc成肌细胞GLUT4myc转位

图4 C2C12成肌细胞SOCS3 m RNA和蛋白水平

3、讨论

本研究中探讨了Reparixin对PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的影响及其潜在机制。过量游离脂肪酸（FFA）造成的脂毒性是胰岛素抵抗的重要机制之一[7]，其中又以饱和游离脂肪酸（SFAs）作用最为主要。研究表明，当SFAs在细胞内水平超过其线粒体氧化水平时，会转化为有害的脂质，如二酰甘油和神经酰胺。其中二酰甘油会激活蛋白激酶C(PKC),PKC通过抑制IRS-1的磷酸化损害胰岛素信号通路并且导致胰岛素抵抗，进而发展为2型糖尿病[8,9]。PA作为一种饱和脂肪酸，在过量时可诱导细胞内炎症和氧化应激，进而导致胰岛素信号通路受损和胰岛素抵抗的发展[10]。本研究用PA构建C2C12成肌细胞胰岛素抵抗模型[11]，发现PA降低了胰岛素刺激的胰岛素信号通路蛋白的磷酸化，并且抑制了葡萄糖的摄取，表明PA成功诱导了C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。而Reparixin逆转了PA的作用，提示Reparixin具有改善PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的作用，这是首次发现Reparixin对骨骼肌细胞胰岛素抵抗的影响。

胰岛素信号通路是调节机体糖代谢的关键机制，参与2型糖尿病和胰岛素抵抗的发生[12]。胰岛素通过结合其受体（IR）启动一系列下游信号转导事件，其中最为关键的是PI3K和Akt的激活[13]。Akt的激活进一步激活下游的AS160,AS160促进GLUT4转位至细胞膜，从而增加细胞对葡萄糖的摄取能力，维持血糖稳定[14]。在胰岛素抵抗状态，这一信号通路受到干扰，尤其是Akt激活的减弱，导致GLUT4转位和细胞对葡萄糖摄取的能力下降，最终导致血糖水平升高[15]。

GLUT4具有胰岛素敏感性，主要在骨骼肌和脂肪组织中表达，对于维持全身葡萄糖稳态至关重要[16]。在胰岛素作用下，GLUT4从胞内储存小泡快速转位至细胞膜，增加细胞表面GLUT4的数量，从而促进葡萄糖的摄取[17]。因此，任何影响Akt激活或GLUT4转位的因素都可能导致胰岛素抵抗的发展。本实验室构建过表达GLUT4myc的C2C12-GLUT4myc细胞株，检测GLUT4myc的转位，从而反映细胞的葡萄糖摄取情况。本研究发现Reparixin通过促进C2C12-GLUT4myc细胞GLUT4myc转位，恢复胰岛素信号通路的正常功能，改善了胰岛素抵抗状态。这一发现为进一步探索Reparixin在治疗2型糖尿病中的潜力提供了基础。

笔者进一步探讨了Reparixin改善C2C12成肌细胞胰岛素抵抗的机制。SOCS3是一个关键的细胞内蛋白，其主要功能是通过抑制特定的细胞信号通路来调节细胞内信号转导[18]。SOCS3减弱IRS对胰岛素的响应，削弱胰岛素信号转导，抑制IRS-1-PI3K-Akt信号通路，从而导致胰岛素抵抗，抑制SOCS3有望成为治疗胰岛素抵抗以及2型糖尿病的新靶点[4]。有报道称胰岛素抵抗的肥胖动物肝脏SOCS3表达水平显著升高，肝脏中过表达SOCS3诱导全身胰岛素抵抗[19]，抑制糖尿病小鼠肝脏SOCS3可使受损的胰岛素敏感性得到改善[20]，同时，抑制SOCS3显著可改善肝脂肪变性[21]。以上研究表明SOCS3与胰岛素抵抗有关，并且抑制SOCS3的表达可以改善胰岛素抵抗。笔者的结果显示，PA升高C2C12成肌细胞SOCS3的m RNA和蛋白表达水平，表明其可能通过上调SOCS3水平诱发胰岛素抵抗，而Reparixin部分逆转了PA的作用，并且部分逆转PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗以及葡萄糖摄取，Reparixin可能通过抑制SOCS3基因表达，改善PA诱导的C2C12成肌细胞胰岛素抵抗。

综上所述，本研究发现Reparixin能够改善PA诱导的小鼠C2C12成肌细胞的胰岛素抵抗，并且Reparixin发挥作用的机制之一是抑制SOCS3基因的表达，证明Reparixin具有改善胰岛素抵抗的作用，并且SOCS3有可能成为治疗2型糖尿病的潜在靶点。

基金资助:国家自然科学基金面上项目(82270856);

文章来源:盛菲,倪钰鸽,牛文彦.瑞帕利辛改善棕榈酸诱导的骨骼肌细胞胰岛素抵抗[J].天津医科大学学报,2024,30(04):338-342.