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TTK基因眼睑基底细胞癌中的表达及对恶性肿瘤细胞生物学行为影响

2025-04-30 47 上传者：管理员

摘要：目的探索苏氨酸和酪氨酸激酶(TTK)基因与眼睑基底细胞癌(BCC)的相关性。方法本研究基于GEO数据库，利用生物信息学方法筛选出与BCC肿瘤发生发展相关的核心基因TTK。收集资阳市中心医院手术切除的眼睑BCC组织标本(随着BCC恶性程度加重，将BCC细胞分为BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组)与眼睑良性肿瘤组织标本(设为Control组)进行后续实验比较。采用细胞免疫荧光法(CIA)检测TTK基因在眼睑良性肿瘤细胞和BCC细胞中的表达；慢病毒转染BCC细胞敲低TTK后[分别转染LV-TTK-shRNA(设为TTK-shRNA组)和阴性对照序列LV-BCC-shRNA(设为BCC阴性对照组)],采用CIA检测各组细胞中凋亡信号通路中关键蛋白Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果生物信息学方法筛选出与BCC肿瘤发生和发展相关的核心基因为TTK。CIA检测结果显示，Control组、BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组肿瘤细胞质中荧光强度分别为1.03±0.07、1.28±0.11、1.58±0.13及1.92±0.17,荧光强度逐渐增强，各组间细胞荧光强度比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Control组、BCC阴性对照组及TTK-shRNA组细胞荧光强度分别为1.02±0.05、1.74±0.12及1.31±0.09。与Control组比较，BCC阴性对照组细胞荧光强度增强，TTK-shRNA组细胞荧光强度降低，三组间互相比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。Control组、BCC阴性对照组及TTK-shRNA组细胞中，抗凋亡蛋白BcL-2荧光强度分别为1.04±0.12、2.12±0.23及1.43±0.15;促凋亡蛋白Bax荧光强度分别为1.02±0.08、0.64±0.11及1.47±0.16。TTK敲低后，BCC细胞中BcL-2表达水平降低，Bax表达水平升高，三组间BcL-2及Bax荧光强度组间互相比较，差异均有统计学意义(均为P<0.05)。结论TTK基因参与了眼睑BCC细胞的增殖调控，并且这种作用与PI3K-AKT-Bcl-2/Bax信号通路密切相关。

关键词：
Bax
BCL-2
生物医学信息
眼睑基底细胞癌
细胞免疫荧光法
苏氨酸和酪氨酸激酶
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眼睑基底细胞癌(BCC)是常见的人类恶性肿瘤之一，以眼周最多见，几乎占所有非黑色素瘤皮肤癌的80%，占眼睑癌的90%［1-2］。眼睑BCC主要局限于下睑和内眦［3］;发病人群主要为长期紫外线暴露的中老年人，女性略多于男性［1］。虽然眼睑BCC发病缓慢，恶性程度和转移性较低，但对眼睑造成的畸形和面容的损害是不容忽视的问题［4］。随着现代分子生物学和肿瘤学研究的发展，研究者逐渐认识到恶性肿瘤的发生系多因素、多阶段及多基因异常累积的过程，特别是癌基因的激活和抑癌基因的失活起着十分重要的作用［5-6］。苏氨酸和酪氨酸激酶(TTK)又称单极纺锤体1，能够保证染色体的稳定性，其异常表达可增加染色体不稳定性，从而导致肿瘤发生［7-8］。该过程中，TTK通过延迟有丝分裂的过程来防止染色体的错误分配，从而有效促使拥有不稳定或非整倍体等异常染色体的细胞死亡［9-10］。研究发现，TTK基因的转录在许多人类恶性肿瘤均高度表达，而在正常组织中几乎不表达，提示其有作为诊断和治疗的分子生物标志物的潜力［11-12］。目前对于晚期BCC肿瘤临床仍然缺乏有效的治疗手段［13-14］。因此，本研究通过生物信息学方法筛选眼睑BCC相关核心基因TTK，并检测TTK基因在BCC肿瘤细胞中的表达;观察其对BCC恶性肿瘤细胞生物学行为的影响并探究凋亡机制，旨在为TTK成为BCC肿瘤的分子标志及治疗靶点提供理论依据。

1、材料与方法

1．1生物信息学筛选核心基因及验证

1．1．1数据集的获取与筛选差异表达基因

本研究通过GEO数据库搜索与BCC相关的基因。纳入标准:(1)种属为人类;(2)含有BCC组织和非癌性眼睑组织。排除标准:经放化疗处理后的BCC组织。最后检索得到基因芯片为GSE53819和GSE12452。通过GEO数据库中GEO2Ｒ在线分析工具对GSE53819和GSE12452基因芯片进行数据分析与筛选，筛选条件为:P＜0．05且logFC≥l，将logFC≥1定义为上调，logFc＜l定义为下调，从而获得基因的差异表达，导入到韦恩在线分析工具并取交集得到共同的差异表达基因(DEGs)。

1．1．2蛋白质-蛋白质互作网络分析构建及基因表达验证与预后分析

通过STＲING数据库将DEGs进行蛋白质-蛋白质互作网络分析(PPI)，并通过Cytoscape(v3．9．1)软件构建核心基因模块。通GEPIA(http://gepia．cancer-pku．cn/)对核心基因进行表达水平差异验证，Kaplan-MeierPlotteI(K-Mp1otter，http://kmplot．com//analysis/)进行预后分析［15-16］。

1．2方法

1．2．1临床资料收集及分组

收集资阳市中心医院2015年2月至2022年2月经外科手术切除的眼睑BCC组织标本126例，其中男38例，女68例，年龄53～83(72．45±12．17)岁。所有标本均经同一病理医师检查和诊断证实为眼睑BCC。另收集眼睑良性肿瘤组织标本126例作为控制组(Control组)，本研究通过四川大学华西医院资阳医院医学研究伦理委员会同意批准(批号:2015-167)。

1．2．2细胞实验

1．2．2．1BCC细胞培养

选取资阳市中心医院眼睑良性肿瘤和BCC组织为标本，其中眼睑良性肿瘤组织病理检查分型为基底细胞乳头状瘤，BCC组织病理检查分型为实体型。采用组织块培养法培养良性肿瘤细胞和BCC细胞。在恒温37℃，含体积分数5%CO2的环境中，采用含体积分数10%胎牛血清和10g·L－1青霉素链霉素的DMEM培养基培养，当细胞融合度达到90%时进行传代。BCC组织镜下观察可见细胞呈长梭形，胞浆内可见较多颗粒，细胞大小不一致，生长密集，排列不规则，出现重叠生长，可见接触抑制和密度抑制丧失的现象。本实验取第3～6代细胞进行后续实验。

1．2．2．2细胞免疫荧光法检测

TTK基因在眼睑良性和恶性肿瘤细胞中的表达两组细胞孵育24h后，分别按照细胞爬片-孵育破膜-封闭-一抗-二抗-复染核-制片等过程进行细胞免疫荧光染色。TTK抗体(中国武汉博士德生物公司):PBS=1∶200;光学显微镜下观察TTK在眼睑良性肿瘤细胞和恶性肿瘤细胞中的表达，并记录结果。随着BCC恶性程度加重，将BCC细胞分为BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组。根据国际多质控中心发布的《国际特设专家委员会建议:细胞免疫荧光染色对照标准化》进行阳性等级划分:0级:无明显荧光;I级:弱强度荧光;II级:中等强度荧光;III级:高强度荧光;采用H-SCOＲE评分系统进行统计分析:H-SCOＲE=∑(pi×i)=(弱强度百分比×1)+(中等强度百分比×2)+(强强度百分比×3)(pi为染色细胞百分数，i为染色强度)［17］。

1．2．2．3慢病毒转染

BCC细胞影响Bcl-2和Bax表达及效果验证本研究中慢病毒LV-TTK-shＲNA及阴性对照LVBCC-shＲNA由武汉博士德生物公司设计与合成。将BCC细胞分别转染LV-TTK-shＲNA(设为TTK-shＲNA组)和阴性对照序列LV-BCC-shＲNA(设为BCC阴性对照组)，采用细胞免疫荧光法检测各组细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表达情况［18］。

1．3统计学处理

使用SPSS25．0统计软件进行统计学分析，符合正态分布的计量资料采用均数±标准差表示，涉及重复测量设计时，采用重复测量数据的方差分析，首先分析多组的组间差异性以及各时间点测量值的时间差异性，各时间点的组间差异均应采用两两比较法(LSD-t检验、SNK-q检验)。检验水准:α=0．05。

2、结果

2．1生物信息学筛选核心基因及验证

2．1．1获取共同DEGs结果

本研究通过GEO数据库分别得到2个基因芯片的差异表达基因，经韦恩图在线分析得到587个共同DEGs．其中384个基因表达上调，203个基因表达下调(图1)。

图1GEO数据库中BCC相关基因DEGs韦恩图

2．1．2构建PPI网络及核心基因模块

将共同的DEGs数据导入到STＲING数据库中，得到PPI网络图，然后将数据导入到Cytoscape软件中，利用MCC算法得到连接度排名前20的核心基因模块(图2)，从而选取TTK基因作为后续研究对象。

图2BCC相关基因DEGs数据PPT网络及核心基因模块

2．2BCC中TTK基因的表达情况

如图3所示，Control组细胞形态保持完整，细胞核和核仁结构清晰，未见明显荧光染色。Control组良性肿瘤细胞中TTK基因蛋白荧光强度为1．03±0．07，随着BBC肿瘤细胞恶性程度加重，BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组肿瘤细胞质中荧光强度分别为1．28±0．11、1．58±0．13及1．92±0．17，荧光强度逐渐增强。Control组细胞荧光强度与BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组比较，BCCGradeI组、BCCGradeII组及BCCGradeIII组组间细胞荧光强度比较，差异均有统计学意义(均为P＜0．05)。

2．3慢病毒转染眼睑BCC细胞后效果验证

慢病毒转染BCC细胞72h后采用细胞免疫荧光染色法分析TTK基因表达情况，研究结果显示，Control组、BCC阴性对照组及TTK-shＲNA组细胞荧光强度分别为1．02±0．05、1．74±0．12及1．31±0．09。与Control组细胞荧光强度比较，BCC阴性对照组细胞荧光信号强度增强，TTK-shＲNA组细胞荧光强度降低，三组间互相比较，差异均有统计学意义(均为P＜0．05)(图4)。

图3细胞免疫荧光染色法分析眼睑良性肿瘤和BCC肿瘤细胞中TTK表达情况

图4细胞免疫荧光染色法检测慢病毒转染BCC细胞后各组细胞TTK基因表达水平

2．4敲低TTK对BCC细胞中Bcl-2和Bax的影响

细胞免疫荧光染色法检测结果显示，Control组、BCC阴性对照组及TTK-shＲNA组细胞中，抗凋亡蛋白BcL-2荧光强度分别为1．04±0．12、2．12±0．23及1．43±0．15;促凋亡蛋白Bax荧光强度分别为1．02±0．08、0．64±0．11及1．47±0．16。TTK敲低后，BCC细胞中BcL-2表达水平降低，Bax表达水平升高，三组间BcL-2及Bax荧光强度组间互相比较，差异均有统计学意义(均为P＜0．05)(图5)。

图5细胞免疫荧光染色法检测慢病毒转染BCC细胞后各组细胞Bcl-2和Bax基因的表达水平

3、讨论

BCC是皮肤癌中最为常见的一种，该疾病病理机制复杂，往往涉及遗传易感性的相互作用，包括单核苷酸多态性和遗传综合征，以及散发性体细胞突变等过程［19-20］。有研究表明，眼睑BCC发病率呈逐年上升趋势，好发人群为肤色偏白的老年女性［21］。由于疾病早期BCC病变较局限，未引起患者的足够重视，相当一部分患者就诊时，病变程度已经进入晚期［22］。目前临床对于晚期BCC患者的治疗尚未达到良好效果，随着精准医疗的广泛推进，基因分子靶向精准治疗通过对患者基因测序进行靶向治疗在临床案例中显现出良好的治疗效果［11］。因此，本研究基于生物医学信息法探讨了TTK在眼睑BCC中的表达情况，并进一步采用细胞免疫荧光染色法和Westernblot实验多角度检测肿瘤细胞中TTK基因表达，以及慢病毒转染敲低TTK基因表达后，促凋亡蛋白Bcl-2和抗凋亡蛋白Bax的表达情况，以期为晚期患者寻求新的治疗方法。

TTK是一种重要的纺锤体组装检查点(SAC)激酶，在人类恶性肿瘤中普遍存在过表达，抑制TTK活性会增加染色体分离错误，降低癌细胞活力［23］。研究表明，TTK抑制剂联合化疗或放疗可取得良好的抗癌结果，提示其是治疗癌症的有效靶点［24］。本研究通过GEPIA和Kaplan-MeierPlotter验证了TTK可在眼睑BCC中呈高表达并影响患者预后，上述研究结果预测了TTK对眼睑BCC具有类似作用。本研究进一步通过细胞免疫荧光染色法证实了TTK在眼睑BCC中高表达，实验结果与生物医学信息分析结果相符合，表明TTK基因可作为眼睑BCC诊断及评估其患者预后的潜在指标。同时本研究利用慢病毒转染敲低眼睑BCC细胞中TTK基因表达，结果显示，与BBC细胞中TTK基因荧光强度表达相比，敲低组BCC细胞荧光强度呈低度表达，提示慢病毒转染可以有效抑制BCC细胞中TTK基因表达［25］。既往研究显示，在多种恶性肿瘤中，TTK的表达水平显著增高，并且其高表达与较差的预后密切相关，TTK可促进细胞生长和细胞扩散，以及防止衰老和自噬，敲除TTK可抑制人恶性肿瘤细胞的生长和恶性潜能［26-27］。这些既往研究结果与本研究结果相符合，进一步证实了TTK基因是眼睑恶性肿瘤的相关基因，有可能成为临床应用的新靶点。

研究表明，磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B(PI3K-AKT)通路是一种细胞内信号转导通路，广泛参与细胞生理活动，在维持细胞的正常生理功能，如细胞生长、分化、代谢等方面起着关键作用，可对细胞凋亡、基因转录、蛋白质翻译、代谢、血管新生以及细胞周期等进行调控［28-29］。PI3K/AKT的激活可以通过多种下游途径磷酸化靶蛋白来调控细胞凋亡。其中Bcl-2基因家族在细胞凋亡的基因调控网络中起关键作用，相关报道表明，Bcl-2是一种新的抗凋亡因子，它不影响细胞增殖，而是作为凋亡抑制剂，阻止各种生理和病理刺激引起的细胞凋亡［30-31］。此外，Bax基因属于Bcl-2基因家族，可以促进细胞凋亡。本研究显示，在敲低TTK基因表达后，BCC细胞中促凋亡蛋白Bax表达明显增加，而抗凋亡蛋白Bcl-2降低，从而导致眼睑恶性肿瘤细胞凋亡，结果提示该过程可能与细胞凋亡信号PI3K-AKT-Bcl-2/Bax通路的激活有关［32-33］。研究表明，有丝分裂是一个高度精确有序的过程，纺锤体装配检查点在监督细胞正确分裂过程中发挥重要作用。TTK作为纺锤体装配检查点的核心组分，只有当染色体正确连接时，有丝分裂才能顺利进入后期，否则阻滞于M期［34］。而TTK活性的失衡往往不利于细胞的存活，

4、结论

TTK基因参与了眼睑BCC细胞的增殖调控，并且这种作用与PI3K-AKT-Bcl-2/Bax信号通路密切相关。该研究为眼睑BCC的靶向治疗提供了新的潜在靶点。

基金资助:2024年四川省卫生健康委员会科技项目(编号:24WSXT096,24WSXT098);四川省老年医学学会课题计划项目(编号:24SCLN0115);河北省医学科学研究课题计划(编号:20240294);四川省资阳市医学科学课题计划项目(编号:KY2023001,KY2023023);四川省资阳市科学技术局计划项目(编号:zykjjsc20-yyjc-2023-04);

文章来源:李涛,漆星,张丹,等.TTK基因在眼睑基底细胞癌中的表达及其对恶性肿瘤细胞生物学行为的影响[J].眼科新进展,2025,45(04):280-285.