视网膜母细胞瘤发病率占儿科肿瘤3%左右,若不及时治疗,转移的视网膜母细胞瘤细胞将增加患儿病死率,临床主要采用介入治疗､放射治疗或化学治疗等延长患儿生存率[1-2]｡因而阐明视网膜母细胞瘤发病机制对早期诊断及靶向治疗具有重要意义｡环状RNA(circRNA)属于共价闭合RNA分子,在多种肿瘤中异常表达,可靶向调节微小RNA(miRNA)影响细胞生物学行为,可作为不同肿瘤诊断及治疗的潜在靶点[3]｡研究发现,circRNA在视网膜母细胞瘤中差异性表达,并可调控细胞增殖､迁移等生物学行为,参与视网膜母细胞瘤发生发展过程[4-5]｡环状RNACSPP1(circCSPP1)在肿瘤中呈高表达,敲低其表达可抑制肝癌细胞增殖及转移,促进细胞凋亡,其参与了肿瘤的发生发展过程,并可能成为肿瘤靶向治疗的潜在靶点[6]｡目前,circCSPP1与视网膜母细胞瘤相关研究报道相对较少｡StarBase预测显示circCSPP1与微小RNA-642a-5p(miR-642a-5p)存在结合位点｡miR-642a-5p在前列腺癌中呈低表达,上调其表达可诱导细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,可能成为前列腺癌治疗的潜在靶点[7]｡目前尚未见探讨circCSPP1与miR-642a-5p在视网膜母细胞瘤中表达趋势,以及其在视网膜母细胞瘤细胞中生物学功能的相关结论｡因此,本研究主要明确circCSPP1与miR-642a-5p在人视网膜母细胞瘤细胞增殖､迁移以及侵袭中发挥的作用,以期揭示视网膜母细胞瘤的发病机制,为临床研究提供参考｡

1､材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1临床资料

回顾性选取2019年6月至2022年10月郑州市中心医院收治的视网膜母细胞瘤患者47例47眼为研究对象,接受玻璃体切割术治疗,术中切除患者视网膜母细胞瘤组织､瘤旁组织(距离肿瘤组织约2cm),其中男21例,女26例,年龄3~10(6.32±1.03)岁,分化程度:低分化13例､中分化20例､高分化14例｡纳入标准:单眼发病;术前未接受放射治疗或化学治疗;术后经病理诊断确诊为视网膜母细胞瘤;未合并其他眼部疾病者;既往无眼部手术史者｡排除标准:合并其他恶性肿瘤;伴有急慢性感染者;依从性较差者;伴有遗传性眼部疾病者｡本研究经郑州市中心医院伦理委员会批准(批准号:ZXY202210042),监护人均知情且签署知情同意书｡

1.1.2研究材料

人视网膜母细胞瘤细胞株Y-79购自北京百欧博伟生物公司;杜氏改良培养基(DMEM)､Trizol试剂､Lipofectamine2000购自美国Invitrogen公司;阴性对照核苷酸序列(sh-NC)､circCSPP1的慢病毒短发夹RNA(sh-circCSPP1)､阴性对照mimicNC序列(miR-NC)､miR-642a-5p寡核苷酸模拟物(miR642a-5pmimics)､特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miRNC)､miR-642a-5p特异性寡核苷酸抑制剂(anti-miR642a-5p)购自广州锐博生物公司;空质粒载体(pcDNA)､circCSPP1过表达载体(pcDNA-circCSPP1)购自上海吉玛制药技术有限公司;反转录试剂盒､SYBRGreen试剂盒购自北京天根生化公司;CCK-8试剂､Matrigel基质胶､荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝公司;Transwell小室购自美国Corning公司;兔抗人上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和神经型钙黏蛋白(N-cadherin)一抗､内参GAPDH抗体购自美国SantaCruz公司;山羊抗兔二抗购自美国Abcam公司｡MultiscanMK3酶标仪购自美国ThermoScientific公司;LightCycler96荧光定量PCR仪购自瑞士Roche公司;GelDocXR凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司｡

1.2方法

1.2.1细胞转染及分组

Y-79细胞常规培养后分为Con组(正常培养的Y-79细胞)､sh-NC组(转染sh-NC)､sh-circCSPP1组(转染sh-circCSPP1)､miR-NC组(转染miR-NC)､miR-642a-5p组(转染miR-642a-5pmimics)､sh-circCSPP1+anti-miR-NC组(共转染sh-circCSPP1与anti-miR-NC)､sh-circCSPP1+anti-miR-642a-5p组(共转染sh-circCSPP1与anti-miR-642a-5p)｡Y-79细胞接种于6孔板(每孔2×105个),待细胞生长汇合度达到60%时采用脂质体转染法进行上述转染,转染48h后收集细胞,采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)验证circCSPP1与miR-642a-5p转染效果,然后进行后续实验｡

1.2.2qRT-PCR检测

采用Trizol试剂分别提取瘤旁组织､视网膜母细胞瘤组织及各组Y-79细胞总RNA,逆转录合成cDNA,扩增40个循环后采用荧光定量PCR仪检测circCSPP1与miR-642a-5p表达水平,按照2-ΔΔCt法处理数据｡

1.2.3CCK-8实验检测

细胞增殖取对数生长期Y-79细胞接种于96孔板(细胞密度2×108个·L-1,每孔100μL),按照“1.2.1”方法处理各组细胞,分别于转染24､48､72h后加入CCK-8溶液10μL,于培养箱内培养2h,使用酶标仪检测各孔450nm处吸光度(OD)值｡

1.2.4划痕实验

计算划痕愈合率收集各组细胞(2×108个·L-1)接种于24孔板(每孔200μL),采用20μL枪头垂直孔板背面横线作道痕,弃培养液,加入适量培养基后使用显微镜观察,以此时时间点为0h,待培养24h后取出拍照,依据划痕宽度变化计算划痕愈合率,划痕愈合率=(划痕宽度0h-划痕宽度24h)/划痕宽度0h×100%｡

1.2.5Transwell实验检测

细胞侵袭采用Matrigel基质胶包被的Transwell小室(8μm)进行侵袭分析,取各组Y-79细胞5×105个接种于Transwell小室顶部腔室内,取600μL含有体积分数10%胎牛血清的培养基加入下部腔室内,于培养箱内培养24h后使用体积分数70%乙醇固定侵袭细胞,然后使用10g·L-1结晶紫染色,应用光学显微镜统计侵袭细胞数｡

1.2.6双荧光素酶报告实验

StarBase预测显示circCSPP1与miR-642a-5p存在互补配对序列,将预测结合位点､突变片段分别插入荧光素酶载体,即报告野生型载体WT-circCSPP1､突变型载体MUT-circCSPP1,为明确其是否真实存在结合,采用脂质体转染法将miR-NC､miR-642a-5pmimics分别与WT-circCSPP1､MUTcircCSPP1共转染至Y-79细胞,培养48h后收集细胞并依据试剂盒检测荧光素酶活性｡采用脂质体转染法将pcDNA､pcDNA-circCSPP1､sh-NC､sh-circCSPP1分别转染至Y-79细胞,转染48h后收集细胞并采用qRT-PCR法检测circCSPP1与miR-642a5p表达水平｡

1.2.7Westernblot实验检测蛋白表达量

采用RIPA裂解液裂解各组Y-79细胞,依据BCA试剂盒检测蛋白浓度,取20μg蛋白上样至含体积分数10%凝胶,使用SDS-PAGE分离蛋白,转膜后使用50g·L-1脱脂牛奶封闭2h,膜与E-cadherin(1:1000)､N-cadherin(1:1000)､GAPDH(1:2000)一抗孵育过夜(4℃),次日与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG二抗(1:5000)孵育2h(37℃),滴加ECL工作液观察免疫反应,含有蛋白条带胶片扫描后,使用Quantityone软件进行蛋白定量分析｡

1.3统计学处理

采用SPSS25.0与GraphpadPrism9.0统计学软件分析数据,每组设置3个平行实验,实验重复3次｡计量资料以x-±s表示,采用独立样本t检验比较两组间差异,采用单因素方差分析比较多组间差异,两两比较采用LSD-t检验,检验水准:α=0.05｡

2､结果

2.1circCSPP1与miR-642a-5p在视网膜母细胞瘤组织中的表达水平

视网膜母细胞瘤组织､瘤旁组织中circCSPP1相对表达水平分别为5.28±0.46与1.00±0.09,miR642a-5p相对表达水平分别为0.47±0.05与1.00±0.07,与瘤旁组织比较,视网膜母细胞瘤组织中circCSPP1表达水平升高,miR-642a-5p表达水平降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)｡

2.2沉默circCSPP1表达对细胞增殖､迁移､侵袭的影响

Con组､sh-NC组以及sh-circCSPP1组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.24±0.03､0.23±0.02､0.75±0.06,N-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.66±0.06､0.68±0.05､0.17±0.02｡与Con组及sh-NC组比较,sh-circCSPP1组细胞划痕愈合率均降低,侵袭细胞数均减少,E-cadherin蛋白相对表达水平均升高,N-cadherin蛋白相对表达水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图1､表1)｡

图1沉默circCSPP1表达对视网膜母细胞瘤细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

表1Con组､sh-NC组以及sh-circCSPP1组视网膜母细胞瘤细胞增殖､迁移和侵袭量比较

2.3miR-642a-5p过表达对细胞增殖､迁移､侵袭的影响

Con组､miR-NC组以及miR-642a-5p组细胞Ecadherin蛋白相对表达水平分别为0.22±0.02､0.21±0.02､0.70±0.05,N-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.67±0.06､0.65±0.05､0.24±0.03｡与Con组及miR-NC组比较,miR-642a-5p组细胞划痕愈合率均降低,侵袭细胞数均减少,E-cadherin蛋白水平均升高,N-cadherin蛋白水平均降低,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图2､表2)｡

图2miR-642a-5p过表达对视网膜母细胞瘤细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

表2Con组､miR-NC组以及miR-642a-5p组视网膜母细胞瘤细胞增殖､迁移和侵袭量比较

2.4circCSPP1靶向调控miR-642a-5p的表达StarBase显示,circCSPP1基因序列包含miR642a-5p结合位点(图3)｡miR-NC与miR-642a-5pmimics分别与WT-circCSPP1共转染后荧光素酶活性分别为0.98±0.06､0.34±0.04,miR-NC与miR642a-5pmimics分别与MUT-circCSPP1共转染后荧光素酶活性分别为0.96±0.08､0.99±0.07｡与miR-642a-5pmimics､MUT-circCSPP1共转染比较,miR-642a-5pmimics､WT-circCSPP1共转染后荧光素酶活性降低,差异有统计学意义(P<0.05)｡与转染pcDNA的细胞比较,转染pcDNA-circCSPP1的细胞miR-642a-5p表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)｡与转染sh-NC的细胞比较,转染sh-circCSPP1的细胞miR-642a-5p表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)(表3)｡

图3circCSPP1的序列中含有与miR-642a-5p互补的核苷酸序列

表3不同转染条件下circCSPP1调控miR-642a-5p表达差异比较

2.5干扰miR-642a-5p表达､沉默circCSPP1表达对细胞生物学行为的影响

sh-circCSPP1+anti-miR-NC组与sh-circCSPP1+anti-miR-642a-5p组细胞E-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.77±0.06､0.31±0.03,N-cadherin蛋白相对表达水平分别为0.15±0.02､0.59±0.06｡与sh-circCSPP1+anti-miR-NC组比较,sh-circCSPP1+anti-miR-642a-5p组细胞划痕愈合率升高,侵袭细胞数增多,E-cadherin蛋白表达水平降低,N-cadherin蛋白表达水平升高,差异均有统计学意义(均为P<0.05)(图4､表4)｡

图4干扰miR-642a-5p与circCSPP1表达对视网膜母细胞瘤细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

表4sh-circCSPP1+anti-miR-NC组与sh-circCSPP1+anti-miR-642a-5p组视网膜母细胞瘤细胞增殖､迁移和侵袭量比较

3､讨论

circRNA可充当miRNA海绵分子调节miRNA表达,以及调节细胞增殖､血管生成等生物学行为,进而参与视网膜母细胞瘤发生发展过程,例如circCUL2可通过调节miR-214-5p/E2F2轴影响视网膜母细胞瘤细胞增殖､侵袭､迁移[8];circ_0000527可充当miR-1236-3p海绵分子促进视网膜母细胞瘤细胞侵袭与血管生成[9];circRNF20可靶向调节miR-132-3p表达抑制视网膜母细胞瘤细胞增殖､迁移､侵袭并抑制细胞凋亡[10]｡目前视网膜母细胞瘤治疗常采用眼球摘除术等治疗模式,而肿瘤细胞高侵袭性是导致患者治疗失败的重要原因,因而寻找有效治疗靶点有助于抑制细胞远处转移｡

circCSPP1在结肠癌组织及细胞中表达上调,可促进细胞增殖及转移,circCSPP1可靶向结合miR431,ROCK1与ZEB1为miR-431的靶基因,研究表明,circCSPP1可促进ROCK1与ZEB1的表达参与结肠癌的发生发展过程[11]｡本研究结果显示,视网膜母细胞瘤组织circCSPP1表达水平升高,提示circCSPP1在视网膜母细胞瘤发生发展中发挥癌基因作用｡circCSPP1可竞争性结合miR-944,并正向调节FZD7表达,促进结直肠癌细胞增殖､转移[12]｡circCSPP1在骨肉瘤中表达水平升高,可与miR-200c结合,调节骨肉瘤细胞葡萄糖摄取与细胞增殖,增强葡萄糖代谢,进而参与骨肉瘤的发生发展过程[13]｡由以上研究可推测,circCSPP1可调节癌细胞增殖及迁移等生物学行为,并可能作为肿瘤靶向治疗的潜在靶点｡目前circCSPP1对Y-79细胞生物学行为的调控机制尚未见报道｡与上述研究报道比较,本研究结果显示,沉默circCSPP1后Y-79细胞划痕愈合率降低,侵袭细胞数减少,E-cadherin蛋白水平升高,N-cadherin蛋白水平降低,提示沉默circCSPP1可减弱Y-79细胞增殖､迁移及侵袭能力｡细胞间黏附能力改变与肿瘤侵袭转移密切相关,其中E-cadherin与N-cadherin可介导细胞黏附作用,若E-cadherin表达缺失则细胞发生转移,而N-cadherin表达上调可增强细胞侵袭能力[14-15]｡本研究结果显示,沉默circCSPP1的表达可抑制Y-79细胞增殖､迁移及侵袭｡但circCSPP1在视网膜母细胞瘤发生发展中的作用机制尚需进一步证实｡

本研究结果显示,circCSPP1可靶向结合miR642a-5p｡miR-642a-5p在结肠癌细胞中表达下调,上调其表达可抑制细胞迁移､侵袭及上皮间质转化,其作用机制可能与靶向调控I型胶原蛋白α1表达有关[16]｡miR-642a-5p可靶向调控Notch1表达,促进胶质母细胞瘤细胞凋亡,抑制细胞增殖[17]｡miR642a-5p在宫颈癌细胞中表达下调,可靶向调节天冬酰胺内肽酶表达,抑制细胞增殖及转移,并可诱导细胞周期阻滞于G1期[18]｡本研究结果显示,视网膜母细胞瘤组织中的miR-642a-5p表达水平降低,miR642a-5p过表达可减弱Y-79细胞的增殖､转移能力｡miR-642a-5p在结直肠癌组织中表达下调,上调其表达可靶向丝氨酸羟甲基转移酶2,调节细胞增殖､转移等生物学行为[19]｡由此推测,miR-642a-5p可能作为circCSPP1的下游靶点,进一步调节Y-79细胞的生物学行为｡本研究结果显示,干扰miR-642a-5p表达可减弱沉默circCSPP1表达对Y-79细胞增殖､转移的影响,提示circCSPP1可能通过调节miR642a-5p表达参与视网膜母细胞瘤的发生发展过程｡

4､结论

视网膜母细胞瘤组织circCSPP1表达上调,miR642a-5p表达下调,沉默circCSPP1可通过上调miR642a-5p表达抑制Y-79细胞增殖､迁移及侵袭,circCSPP1可能成为视网膜母细胞瘤靶向治疗的潜在靶点｡

参考文献:

[1]桂馥,吴宏禧,游志鹏,章余兰.miR-21对视网膜母细胞瘤细胞增殖的影响及作用机制[J].眼科新进展,2020,40(7):630-633.

[2]储明慧,陈海银,张晓力.circ_0000144靶向miR-502-5p调控人视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖和凋亡及迁移侵袭[J].国际眼科杂志,2021,21(10):1686-1692.

基金资助:河南省医学科技攻关计划联合共建项目(编号:2018020799);

文章来源:王瑜瑾,王媛,宁丞君.circCSPP1通过调控miR-642a-5p表达对人视网膜母细胞瘤Y-79细胞增殖､迁移､侵袭的影响[J].眼科新进展,2025,45(06):452-456+462.