摘要:目的 探讨沉默信息调节因子2(SIRT2)在膀胱尿路上皮癌(UBC)组织中的表达、临床意义及下调SIRT2后对膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响。方法 利用免疫组化EnVision法检测SIRT2蛋白在95例膀胱尿路上皮癌组织和39例癌旁组织中的表达,分析其与临床病理学参数的关系。采用RT-qPCR检测膀胱癌细胞系中SIRT2 mRNA的表达,Western blot检测膀胱癌细胞系、12对膀胱癌组织中SIRT2蛋白的表达。利用慢病毒感染稳定下调膀胱癌细胞系T24中的SIRT2基因。CCK8法及细胞集落实验检测细胞增殖;Transwell小室法检测细胞侵袭及迁移能力。结果 SIRT2在膀胱尿路上皮癌组织中的阳性表达率为84%(80/95),高于正常尿路上皮组织的5%(2/39)(P<0.05)。SIRT2在高级别尿路上皮癌组表达率为95%(38/40),高于低级别组的76%(42/55)(P<0.05);在肌层侵袭组中表达率为96%(24/25),高于非肌层侵袭组的80%(56/70)(P<0.05)。新鲜膀胱癌组织中SIRT2蛋白表达高于癌旁组织。SIRT2的mRNA及蛋白在膀胱癌细胞系中也均表达上调。在T24细胞中敲减SIRT2,细胞增殖、侵袭及迁移能力均明显下降(P<0.05)。结论 SIRT2在膀胱尿路上皮癌中高表达,干扰SIRT2显著抑制膀胱癌细胞增殖、侵袭及迁移。
膀胱癌(bladder cancer, BC)是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,占全部恶性肿瘤约3.2%[1],发病率居中国泌尿系统肿瘤首位[2]。其中,膀胱尿路上皮癌(urothelial bladder cancer, UBC)占90%以上,非肌层浸润性UBC在经尿道电切联合化学治疗药物膀胱内灌注后都可以得到有效控制,而已有肌层浸润的患者即使经膀胱根治性切除联合化学治疗也无法有效控制病情,并且很快发生复发转移,预后极差[3]。因此,找到新型、特异的分子标志物对于有效遏制UBC起关键作用。
沉默信息调节因子2(silent information regulator 2, SIRT2)属于Sirtuins家族,Sirtuins家族有7个成员,分别为SIRT1-7,通过水解移除组蛋白或非组蛋白赖氨酸残基上的乙酰基,是一类赖氨酸去乙酰基蛋白[4]。SIRT2在胞质中去乙酰化微管蛋白α-tubulin,在胞核中去乙酰化组蛋白残基H4K16、H4K20等,在有丝分裂过程中起稳定染色体的功能[5]。已有报道SIRT2在乳腺癌[6]、结直肠癌[7]、非小细胞肺癌[8]等恶性肿瘤中起重要作用,但其在UBC中的表达及作用还不明朗。本研究从SIRT2在UBC中的表达入手,探索SIRT2与UBC患者病理特征的关系,揭示SIRT2对膀胱癌细胞增殖、侵袭迁移的作用,为膀胱癌治疗提供新的靶点。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1病例资料:
回顾性收集2013年至2018年南通大学附属肿瘤医院病理科UBC患者组织95例,其中39例进行全膀胱切除,56例经尿道膀胱肿瘤电切,39例全膀胱切除标本同时取其癌旁组织。75例为男性,20例为女性,年龄40~83岁(66±9)岁。根据WHO 2016病理分级:55例为低级别、40例为高级别。根据UICC 2009版TNM分期:70例为非肌层侵袭组(T1)、25例为肌层侵袭组(T2-T4)。所有患者术前均未接受放射、化学治疗。该研究获得南通大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(伦理审批号:2019-006)以及患者的知情同意。
1.1.2细胞及主要试剂:
人膀胱癌细胞系(J82, T24, 5637)和正常人膀胱尿路上皮细胞系(SV-HUC-1)(中国科学院上海细胞培养所);?偀?抗单克隆抗体SIRT2(Proteintech公司);GAPDH抗体(CST公司);一抗稀释液和PBS缓冲液(北京中杉金桥公司);二抗和显影液(Dako公司);RPMI1640培养基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶(Gibco公司);CCK8检测试剂盒(Invitrogen公司);细胞培养板、Transwell小室(Corning公司);SIRT2干扰病毒(lentivtrus)(shSIRT2)及其阴性对照(shcon)(上海吉凯技术有限公司制作)。
1.2方法
1.2.1免疫组化检测及判读:
将5μm厚的石蜡包埋组织切片在二甲苯中脱蜡30 min,然后依次经70%、80%、95%、100%乙醇梯度脱水,10 min/道。用蒸馏水冲洗后,浸泡在0.1 mol/L柠檬酸缓冲液中100℃煮沸30 min,进行抗原修复。冷却后经PBS缓冲液冲洗,随后在切片组织上滴加一抗SIRT2(1∶100稀释),室温孵育2 h。用PBS缓冲液冲洗,滴加二抗,室温孵育30 min。再次用PBS冲洗,然后用DAB显色,蒸馏水冲洗。最后用苏木精复染,中性树脂封片。为了证明SIRT2表达的特异性,以PBS代替一抗作为阴性对照。
由2名病理科副主任医师采用双盲法独立进行免疫组化结果判读。SIRT2主要分布于细胞质中,少量分布于细胞核中。根据染色范围评分,每张切片在400倍镜下随机选取5个视野,每个视野计数约500个细胞,计算各视野中阳性细胞数的平均百分数:≤1%定为0分,>1%~10%定为1分,>10%~50%定为2分,>50%~75%定为3分,>75%定为4分。根据染色强度评分:未着色定为0分,淡黄色定为1分,黄色或棕黄色定为2分,棕黄色或棕褐色定为3分。将两项得分相乘,0分为阴性表达,1~2分为低表达,3~6分为中等表达,>6分为高表达。
1.2.2细胞的培养:
将膀胱癌细胞及正常膀胱尿路上皮细胞在添加10%胎牛血清的RPMI1640培养基中进行培养,置于含5% CO2的37℃培养箱中,2 d换液1次,适当传代。
1.2.3 CCK8法检测细胞增殖:
取对数期细胞,胰蛋白酶消化后计数,96孔板中每孔加入100μL细胞悬液,培养板在培养箱中培养48 h后,PBS漂洗每孔细胞,后立即加10μL CCK-8试剂/孔,培养箱内孵育1~2 h。在避光条件下,酶标仪读取波长450 nm处各孔的吸光度(A)值,绘制曲线。
1.2.4集落形成实验检测细胞集落形成:
取对数期增殖的细胞,胰蛋白酶消化后计数,1 000个/孔种植于6孔板内,每5 d更换1次培养基,培养2周。4%多聚甲醛固定30 min,结晶紫染色,最后计数。
1.2.5 Western blot检测膀胱癌组织、癌旁组织及膀胱癌细胞中SIRT2蛋白表达:
冰上裂解组织,收集蛋白,进行定量。在泳道中加样,随后电压100 V进行电泳。当溴酚蓝跑到凝胶底部后进行转膜,恒定电流300 mA,1 h。转膜后,置于5%脱脂奶在室温下封闭1 h。稀释一抗SIRT2(1∶1 000),4℃下孵育过夜。第2天用TBS-T缓冲液摇洗3次,每次5 min。随后室温孵育二抗2 h, TBS-T再次摇洗3次,每次5 min。最后,ECL显色,胶片曝光。
1.2.6 Transwell小室法检测细胞迁移:
取对数期的细胞接种于6孔板,48 h后,使用胰蛋白酶消化制成细胞悬液,计数板计数。用基培重悬细胞,调整细胞至1×106/mL。在Transwell上室加入100μL细胞悬液,下室加600μL含10%胎牛血清的完全培养基。置于培养箱24 h后,弃除上下室的培养基,棉签轻擦上室的细胞,下室加PBS漂洗3次。用10%预冷的多聚甲醛固定细胞5 min,将小室移至新的培养板中,加入0.5%结晶紫溶液染色5 min,随后再次用PBS漂洗3次。取出小室,倒扣在载玻片上,显微镜下观察移到下层的细胞,计数100倍镜下、5个视野的穿膜细胞数,拍照。
1.2.7 Transwell小室法检测细胞侵袭:
用无血清培养基稀释融化Matrigel,加60μL在Transwell上室,在Matrigel凝固后,在上室加入用基培稀释的细胞悬液,其余步骤同1.2.6。
1.3统计学分析
实验结果数据以均值±标准差(x¯±s)表示,利用SPSS 21.0软件进行统计学处理,采用非参数卡方检测各组间的SIRT2的表达差异,采用T检验比较两组数据间的差异。
2、结果
2.1 SIRT2在UBC组织中高表达
在UBC组织中,SIRT2主要表达在细胞质及细胞核中(图1)。在癌组织中SIRT2阳性表达率显著高于癌旁黏膜组织(P<0.05)(表1)
图1免疫组化检测SIRT2在膀胱尿路上皮癌及癌(UBC)旁组织中的表达
表1 SIRT2在UBC组织中的表达分析
2.2 SIRT2的表达与病理学参数的相关性
低级别组UBC中SIRT2表达的阳性率显著低于高级别组,表明SIRT2与UBC的病理分级呈正相关。T1组(非肌层侵袭组)中SIRT2的阳性率低于T2-T4组(肌层侵袭组),表明SIRT2与UBC的临床分期呈正相关。以上结果表明,UBC病理分级越高、临床分期越晚,SIRT2表达水平越高(表2)。
表2 SIRT2的表达与UBC临床病理特征的关系
2.3 SIRT2在UBC组织及细胞中高表达
在12对UBC组织及癌旁组织中,SIRT2蛋白均显著高表达(图2A)。膀胱癌细胞系(J82, T24, 5637)中SIRT2的mRNA及蛋白表达水平均高于正常膀胱尿路上皮细胞系(SV-HUC-1),其中T24细胞表达最高(图2B、C)
2.4敲减SIRT2对细胞增殖的影响
选取SIRT2表达最高的T24细胞,利用慢病毒感染稳定敲减SIRT2基因(图3A,B)。抑制SIRT2表达后,T24细胞集落形成能力显著下降(图3C,D)。下调SIRT2后,细胞增殖能力明显降低(图3E)。
图3稳定敲减SIRT2,细胞集落实验及CCK8法检测细胞增殖能力
2.5敲减SIRT2对T24细胞侵袭、迁移能力的影响
稳定敲减T24细胞中的SIRT2,侵袭、迁移至下室的细胞数量明显减少,表明敲减SIRT2可以抑制膀胱癌细胞侵袭、迁移(图4)
图4 Transwell小室法检测稳定敲减SIRT2的T24细胞侵袭迁移能力
3、讨论
膀胱癌是中国泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一,发病率居男性泌尿系统肿瘤首位[2]。膀胱癌高发年龄为50~70岁,男性发病率约为女性的3倍。
虽然大约70%的膀胱癌患者最初为非肌层侵袭,其5年复发率仍高达30%~80%,并且10%~25%最终会进展为肌层浸润性膀胱癌[3]。肌层侵袭性膀胱癌的侵袭和转移能力很强,病死率很高。因此,找到促膀胱癌发生发展及侵袭转移的关键因子将能有效遏制其发展,改善预后。众所周知,细胞衰老缺陷是肿瘤发展的一个重要因素,因此,靶向识别抗衰老基因有可能预防和抑制肿瘤的发生[9]。
Sirtuins家族成员可以调节细胞衰老、基因沉默、能量代谢、肿瘤发生发展等一系列生理及病理过程[4]。目前研究最多的是SIRT1,课题组也报道过SIRT1在乳腺癌发生发展及耐药中的作用[10]。近年来,SIRT2因为具有与SIRT1相似的作用底物及功能而受到越来越多的关注。SIRT2主要存在于细胞质,但在有丝分裂期可以穿梭至细胞核,具有在有丝分裂过程中稳定染色体的功能[5]。已有报道SIRT2通过去乙酰化H4K16、H3K56、α-tubulin、PR-Set7、NF-κB基团p65、FOXO和受体作用蛋白RIP1等,调控细胞周期、细胞凋亡和压力反应等过程[11]。研究表明,SIRT2在肿瘤发生发展过程中扮演重要角色。SIRT2在某些癌中表达下调,研究发现SIRT2表达缺失的小鼠更易罹患肿瘤,SIRT2敲除后,雌性小鼠易发生乳腺癌、雄性小鼠则易发生肝癌和肠癌[12]。同时,也有报道SIRT2抑制剂具有抗癌作用,SIRT2在抗肿瘤治疗中发挥重要作用[7,8]。因此,SIRT2在肿瘤中的功能与肿瘤细胞所处微环境及其上下游的作用底物有关,并与其去乙酰化功能密不可分。
综上所述,SIRT2在膀胱癌组织中表达上调,并与肿瘤级别高、分期晚呈正相关。干扰SIRT2可有效抑制肿瘤细胞增殖、侵袭及迁移。因此,一方面,通过SIRT2的表达水平可能可以提早预测膀胱癌是否会发生肌层侵袭;另一方面,靶向抑制SIRT2可以阻止肿瘤细胞的增殖及侵袭转移,从而成为一种新的、有效的治疗膀胱癌的方法。
基金资助:南通市卫健委面上课题(MB2021045)
文章来源:金晓霞,陆晓云,刘玉山等.SIRT2在膀胱尿路上皮癌中的表达、临床意义及其对癌细胞增殖、侵袭和迁移的影响[J].基础医学与临床,2023,43(07):1090-1096.
化疗相关性血小板减少症(chemotherapy-induced thrombocytopenia, CIT)定义为化疗后血小板计数低于100×109/L[1],发生在15%~25%的癌症患者中,是导致化疗减量或延迟的重要原因[2,3]。对于CIT的治疗,目前临床处理主要以输注血小板、使用重组人白介素-11(recombinant human interleukin-11,rhIL-11)及重组人血小板生成素(recombinant human thrombopoietin, rhTPO)等为主[4]。
2024-04-09肿瘤细胞具有维持细胞增殖信号传导、逃避生长抑制因子、抵抗细胞死亡、实现复制“永生”、诱导血管生成以及激活侵袭和转移等特征[1]。肿瘤细胞生存的必要条件就是能量的蓄积,磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1,PGK1)是糖酵解途径中第一个产生能量的代谢酶,这奠定了其在肿瘤细胞增殖和代谢中的重要地位。
2024-04-09嗜铬细胞瘤/副神经节瘤(pheochromocytoma and paraganglioma, PPGL)是一种可以合成、分泌大量儿茶酚胺的神经内分泌肿瘤。PPGL临床常表现为血压升高、头痛、心悸、大汗等症状,其定性诊断依赖于血、尿儿茶酚胺及其代谢产物的测定,定位诊断则有赖于CT检查和放射性核素显像。所有PPGL均具有转移潜能,PPGL的转移被定义为在非嗜铬组织如骨、肝、肺、淋巴结、脑或其他软组织中出现了病灶[1]。
2024-03-29随着基因芯片技术的发展,研究人员能够快速、方便地获取大量基因表达谱数据[1]. 这些典型的高维数据通常拥有成千上万个特征,其中包含了大量与疾病诊断无关、被噪音污染、冗余的特征. 如何从基因表达谱数据中挖掘有价值的特征,方便研究人员研究新的药品对症下药,受到越来越多研究者的关注[2].
2024-03-20多发性骨髓瘤(MM)是一种以骨髓中浆细胞单克隆增殖为特征的血液系统恶性肿瘤,发病率约占血液系统恶性肿瘤的10%[1],是目前第二常见的血液系统肿瘤[2]。虽然新型药物及免疫治疗的发展使MM患者的预后得到了极大的改善,但目前仍无法治愈[3]。自然杀伤(NK)细胞是一类具有强大自然杀伤活性的先天性免疫淋巴细胞,能够识别并消灭肿瘤细胞和病毒感染细胞,MM患者NK细胞的数量和功能均受到抑制,导致对骨髓瘤细胞的免疫监视和清除能力降低。
2024-01-29胎儿颈部淋巴水囊瘤(cystic hygroma,CH)是常见的一种严重先天性发育异常,多发生于早孕期,90%以上发生于颈部,主要临床特征是由于淋巴管发育异常导致软组织内出现单个或多个囊肿,其内含有透明或浑浊的液体。CH病因不明、预后评估困难且治疗效果差,目前比较公认的病理学说是淋巴管发育的紊乱或延迟。
2024-01-24血小板反应蛋白(thrombospondins, THBSs)是一个基质细胞钙结合糖蛋白家族,由5种基质细胞蛋白组成,分为两个结构亚群,即三聚体亚组A(THBS1和THBS2)和五聚体亚组B(THBS3、THBS4和THBS5)。THBSs能够与细胞外基质和细胞表面的多种生长因子、受体、基质分子或蛋白酶等相互作用,介导细胞外基质组装、细胞与基质相互作用,参与调节多个生物学过程,包括组织重塑、血管生成、细胞增殖、细胞凋亡和肿瘤发生,其机制极其复杂[1]。
2023-12-06神经内分泌肿瘤(NENs)起源于神经内分泌细胞和肽能神经元,具有一定的分泌特征,可产生一系列多肽激素,能从惰性、生长缓慢进展至高转移性、明显恶性特征的一种高度异质性肿瘤[1]。NENs以消化系的肿瘤类型最为常见,胃肠及胰腺发病者占65%~75%[2]。过去因技术限制认为NENs罕见,并以“类癌”称呼,但随着医疗水平不断发展,病理学诊断技术提升及对该疾病的认识加深,近几年NENs的检出率逐年升高,有研究报道过去30年其发病率增加了5倍[3]。
2023-11-10结直肠腺瘤(colorectal adenoma,CRA)是发生在结直肠黏膜上突向肠腔的隆起性病变,是结直肠癌最常见的癌前病变。结直肠腺瘤多起病隐匿,临床上对本病中医辨证的标准主要采取定性描述方式,缺乏对其证候的客观量化,使诊断存在一定主观性,也给结直肠腺瘤的流行病学证候调查及临床诊治带来了困难。
2023-10-18髓系肉瘤(myeloid sarcoma, MS)又称绿色瘤、粒细胞肉瘤、骨髓外髓细胞肿瘤,是一种罕见的髓系原始细胞髓外增殖的恶性血液系统肿瘤,可发生于全身各组织器官系统[1]。欧洲血液协会根据MS的多种髓外表现将其分为4种类型:MS合并急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML);AML的髓外复发,包括骨髓移植后 复发;骨髓增殖性肿 瘤(myeloproliferative neoplasm, MPN)或慢性粒-单核细胞白血病的急变期/转化。
2023-10-10人气:18335
人气:8035
人气:6355
人气:6150
人气:5193
我要评论
期刊名称:基础医学与临床
期刊人气:1993
主管单位:北京市科学技术协会
主办单位:北京生理科学会
出版地方:北京
专业分类:医学
国际刊号:1001-6325
国内刊号:11-2652/R
邮发代号:82-358
创刊时间:1981年
发行周期:月刊
期刊开本:大16开
见刊时间:1年以上
影响因子:0.458
影响因子:0.560
影响因子:0.448
影响因子:0.731
影响因子:0.710
400-069-1609
您的论文已提交,我们会尽快联系您,请耐心等待!
你的密码已发送到您的邮箱,请查看!